Без кейворду

Примітка: Будь ласка, розповсюдьте цю інформацію в якомога більшій кількості джерел, форумів, клубів, журналів, магазинів та інших місць. Будь ласка, направте зацікавлені сторони до цієї статті або зв’яжіться зі мною електронною поштою за адресою eborneman@uh.edu.

Передумови та вступ

Протягом багатьох років елегантні корали (Catalaphyllia jardinei) були одними з найпростіших коралів для утримання в акваріумах. За останні п’ять років більшість з них, що потрапляють в торгівлю, приречені через стан, для якого немає відомої причини або лікування. У цьому стані корал приймає відносно роздутий ротовий диск з бахромою невитягнутих щупалець. Тканина корала з часом скорочується, і корал гине, незважаючи на всілякі експериментальні втручання.

Більшість каталафілій на цій фотографії мають нормальний здоровий вигляд, за винятком тієї, що демонструє характерні зморщені щупальця і (зазвичай) аномальне забарвлення.

У деяких випадках може бути присутня біла непрозора слизоподібна павутина. Я не впевнений, чи є це абсолютно окремим станом, якось пов’язаним, вторинним по відношенню до основного стану, або частиною того ж самого стану.

Було багато спекуляцій щодо того, чому цей стан зараз виникає, і різні джерела пропонували причини і навіть способи лікування. Але я підкреслюю, що, наскільки мені відомо, жодних досліджень цього стану не проводилося, і на сьогоднішній день жодна з потенційних причин, рішень або способів лікування, здається, не має достатньої обґрунтованості.

Ці корали надзвичайно красиві і бажані. На жаль, сьогодні їх низький рівень виживання в неволі ставить їх в один клас з Goniopora stokesi, де рівень виживання занадто низький, щоб виправдати широкомасштабний збір їх з дикої природи. Насправді, каталафілії є відносно рідкісними видами і можуть бути надмірно зібрані, так що популяції в деяких районах збору знаходяться під загрозою зникнення або навіть локального вимирання. Продовжувати збирати рідкісні види, які мають надзвичайно низьку виживаність, погано для всіх – це економічні втрати, марнотратство ресурсів і джерело великого розчарування для всіх тих, хто купує і намагається зберегти їхнє життя.

Не всі каталафілії мають ознаки цього захворювання. Іноді я бачу їх у магазинах з нормальним здоровим виглядом. Під час обстежень місць збору коралів я ніколи не бачив жодного корала з таким станом в дикій природі, а з сотень, що утримуються в акваріумах для експорту, лише один екземпляр показав ознаки патології. Безумовно, каталафілії збираються з кардинально різних типів середовищ існування, і можуть бути зібрані з зовсім інших місць, ніж ті, де вони були зібрані багато років тому, коли їх було легко утримувати. Я міг би логічно припустити багато потенційних причин їхнього нинішнього стану та загибелі, але, на жаль, ці припущення нічим не кращі за повне нерозуміння цього стану, яке існує на сьогоднішній день.

Через бажаність і величезну популярність каталафілії, а також для того, щоб дізнатися більше про цей маловивчений вид, і щоб допомогти забезпечити популяції диких елегантних коралів і їх успіх в неволі, я пропоную провести офіційне дослідження цього стану, щоб спробувати визначити його причину і будь-які можливі рішення, щоб ми знову могли насолоджуватися здоровими елегантними коралами в наших акваріумах.

Сферою моєї наукової діяльності є дослідження захворювань коралів з невідомою на даний момент етіологією. Я хотів би добровільно запропонувати свої послуги, щоб допомогти знайти відповіді на питання про стан елегантних коралів. Разом з деякими моїми колегами, я вірю, що ми зможемо визначити причину високої смертності від цього захворювання. Я намагатимусь зробити це у найбільш економний та ефективний спосіб, і по завершенню надам результати на всі відповідні форуми.

Пропоную зібрати фінансування і матеріали для проведення цієї роботи, причому зробити це поетапно, щоб не вимагати більше фінансування або матеріалів, ніж це необхідно.

Каталафілію потрібно буде придбати з різних джерел, як здорових, так і уражених захворюванням. У деяких випадках можуть знадобитися спеціальні заходи з транспортування, щоб уникнути затримок або впливу, який може заплутати будь-які попередні умови, що існували в дикій природі. Корали будуть відправлені або живими, або мертвими і законсервованими для аналізу. Як правило, буде використовуватися формалін або спиртовий фіксатор, і не всі матимуть доступ до деяких фіксуючих матеріалів. Потім я буду досліджувати корали, працюючи від найбільш очевидного до менш очевидного. Зовнішні та грубі зміни будуть задокументовані на живих зразках з чітким описом ознак, змін, часових рамок та долі корала, над яким відбувається стан. Я розгляну колонізацію поверхневої флори і фауни, використовуючи стерильні тампони, і візьму зразки для живого матеріалу і заморожу їх для будь-якої майбутньої молекулярної роботи, яка може знадобитися. Я підготую гістограми для вивчення мікроструктури і пошуку очевидних аномалій в тканинах або зооксантелах, а також наявності або відсутності внутрішньоклітинних паразитів або патогенних мікроорганізмів. На цьому етапі щось може дати про себе знати, а може і не дати. Я підготую звіт, запропоную свої найкращі пропозиції для наступної фази, якщо причина все ще невідома, і окреслю наступний запит на фінансування та матеріали.

Початкові вимоги

Спочатку, принаймні, єдине, що мені знадобиться, це корали – якомога різноманітніші в часі та просторі. Наприклад, замовлення 100 коралів у одного і того ж оптовика в одну і ту ж дату буде набагато менш цінним, ніж жменька з декількох джерел протягом різних періодів часу, щоб збільшити різноманітність зразків. Мені знадобляться елегантні корали з якомога більшої кількості джерел. Нижче наведені джерела, які в ідеалі повинні бути використані для отримання зразків матеріалу.

Безпосередньо з дикої природи Експортні підприємства Оптові підприємства Роздрібні підприємства Домашні акваріуми

Здорові корали – найскладніше

Живі корали Я хотів би отримати 5-10 здорових елегантних коралів, принаймні два з яких повинні бути доставлені безпосередньо з джерела в мою лабораторію або в установу, яка готова гарантувати, що зразки потрапляють безпосередньо в чистий критий резервуар зі свіжоприготовленою морською водою з використанням бутильованої дистильованої води і чистих рук в рукавичках. Дивіться протоколи нижче. Я намагатимусь зв’язатися з джерелами цього матеріалу, хоча, якщо хтось має такі контакти і можливості, їхні зусилля будуть дуже вдячні.

Що стосується решти здорових зразків, то потрібен хтось із достатнім досвідом, щоб визначити, чи дійсно даний зразок виглядає як такий, що не уражений хворобою. Для цього потрібна або установа з регулярним оборотом каталафілій, або волонтери, які б обходили місцеві магазини, щоб знайти ті рідкісні, здорові екземпляри. У будь-якому випадку, я вважаю, що перед придбанням або відправкою слід надіслати мені фотографію для підтвердження того, що вона дійсно не уражена. Якщо виявиться, що він уражений, це не проблема, оскільки він все одно буде сприяти дослідженню. Однак я повинен придбати живі здорові зразки в якості контролю. Якщо здоровий (або підозрілий на здоров’я) корал буде знайдений і наданий, мені потрібно, щоб цей корал був ретельно зібраний і відправлений, щоб уникнути будь-яких нових джерел забруднення. Процес буде описаний нижче в розділі “Методи”.

Зразки тканин Я знаю, що бачив принаймні кілька фотографій з акваріумів акваріумістів, у яких в акваріумах є, очевидно, здорові елегантні корали. У мене також є один. Для тих, хто має здорові елегантні корали і хоче зберегти їх у своєму акваріумі (ймовірно, кожен!), можна використовувати зразок тканини. У розділі методик нижче описана процедура.

Живі корали Catalaphyllia з ознаками захворювання можуть бути підготовлені і відправлені за тим же протоколом, що і для здорових коралів. Вони можуть бути з будь-якого джерела, де вони знайдені.

Дуже важливо переконатися, що ніякого додаткового забруднення не відбувається, поки я не отримаю їх. Наприклад, якщо цей стан викликаний бактерією, і акваріумісти хапають корали руками, а я беру поверхневі зразки і виявляю, що більшість або всі мають незвичайну присутність неморських типів стафілококів на них, я помилково буду розглядати стафілококи як можливого збудника захворювання. Було б марнотратством проводити дослідження культури і реінфекції з метою виконання постулатів Коха, коли всі ці мікроби є артефактами людського поводження. Те ж саме стосується впливу повітря – ми дійсно хочемо обмежити кількість плісняви, грибків, бактерій та інших мікробних організмів, які поширені в повітрі та на поверхнях, які можуть заплутати тести і зробити дослідження довшим, дорожчим і складнішим.

Фіксовані мертві корали Якщо знайдено уражену каталафілію, яку неможливо доставити мені живою, я можу використовувати цілий корал або зразки тканин фіксованого матеріалу. Наприклад, якщо хтось придбав або побачив каталафілію, яка, на його думку, не має шансів на виживання і може навіть не пережити процес транспортування, її можна вбити і зафіксувати для вивчення. Аналогічно, магазини та акваріумісти, які мають доступ до уражених коралів і бажають пожертвувати зразки тканин або корали, але тільки якщо вони не живі з будь-якої причини, можуть зробити це шляхом фіксації. У розділі “Методика” нижче описано цю процедуру.

Скелети, фотографування, прямі підрахунки та мазки з поверхні

Якщо хтось хоче зробити свій внесок у це дослідження, але не може зробити це жодним з вищезазначених способів, все ж таки є деякі важливі дані, які можна отримати. Я можу використовувати скелети мертвих каталафілій, фотографії уражених живих каталафілій та фотографії скелетів нещодавно померлих каталафілій, а також стерильні мазки з поверхні уражених коралів з акваріумів або з приміщень. Я не вважаю, що жоден з цих матеріалів не надасть переконливих доказів чогось, але потенційно може бути використаний для підтримки інших висновків.

Скелети можуть бути цінними через наявність або відсутність різних організмів. Присутність або відсутність бурих водоростей, грибів, молюсків, ракоподібних та інших представників флори і фауни може бути випадковою або постійною і може заслуговувати на подальше дослідження, щоб з’ясувати, чи відіграють вони якусь роль у стані.

Фотографія є допоміжним засобом і може бути корисною з точки зору документування. Вона також може надати докази грубих змін або факторів, що впливають на стан.

Ще одна інформація, яка може бути корисною, – епізоотологічна. Було б добре мати певне уявлення про виникнення цього стану. Якщо хтось відвідує такий об’єкт, як рибний магазин, оптовий продавець або інше джерело, простий підрахунок кількості присутніх елегантних коралів та кількості уражених колоній був би дуже корисним. Будь ласка, вкажіть дату підрахунку, своє ім’я та контактну інформацію, а також назву об’єкта разом з інформацією про підрахунок. Інформацію можна надіслати мені на електронну адресу: eborneman@uh.edu.

Стерильні мазки з поверхні коралів можуть бути цінними, якщо стан включає зміни нормальної біотичної флори, або якщо є паразит або патогенний мікроб, який впливає на корал, колонізуючи його поверхню. У цьому випадку стерильні мазки можуть бути корисними, якщо детальне дослідження тканин покаже, що це є причиною.

Всі протоколи для цієї роботи описані нижче в розділі “Методика”.

Надання живих коралів для дослідження (здорових або хворих)

Вода, в якій знаходиться корал, або свіжоприготовлена морська вода повинна бути приготовлена з використанням бутильованої дистильованої води та чистих соляних ложечок із закритих контейнерів з сіллю. Корал або будь-які інструменти, що контактують з водою або коралом, не повинні використовуватися, якщо вони не були попередньо асептично оброблені спиртом або комерційним асептичним скрабом, таким як Hibiclens.

Для приготування або збору води використовуйте скляну ємність, ретельно протерту медичним спиртом (бажано 90%) або етанолом. Всі інструменти, що використовуються для додавання солі і перемішування ємності, також повинні бути очищені. На руки слід надіти латексні оглядові рукавички, протерті спиртом, або вимити руки асептичним скрабом типу Hibiclens чи протерти спиртом. Після миття уникайте торкання немитої шкіри, волосся, одягу або інших поверхонь.

Потім воду слід вилити в транспортний пакет або контейнер. Якщо це пакет (Ziploc або пакет для риби), то він повинен бути новим, відносно герметичним і не залишатися відкритим для доступу повітря. Якщо це контейнер (Tupperware або подібний), то перед додаванням води його внутрішня поверхня повинна бути протерта спиртом.

Корали повинні бути швидко вилучені з ємності і поміщені в підготовлену воду, яка знаходиться в транспортному контейнері. Саму тканину слід якомога менше торкатися, захоплюючи її за скелет. Для акваріумістів, яким необхідно скористатися місцевим магазином для пакування та транспортування, закритий контейнер слід віднести в магазин і повторити ту ж саму процедуру для перекладання в інший транспортний пакет. В ідеалі, корали будуть відправлятися з використанням подвійного пакета з киснем, з більшою кількістю повітря, ніж води в пакувальному мішку. Якщо використовується стиснене повітря, наповнювальний наконечник слід протерти спиртом перед тим, як вставити його в мішок для наповнення.

Потім контейнер слід швидко запечатати і відправити. Всі ці процедури повинні бути ретельно розраховані за часом, щоб звести до мінімуму тривалість транспортування. Як правило, це означає роботу в другій половині дня, щоб пізніше в другій половині дня забрати контейнер. Див. протокол транспортування нижче.

Відбір зразків тканин

Якщо надаються зразки тканин або фіксовані зразки коралів, будь ласка, дотримуйтесь тих же асептичних методів, описаних вище, навіть якщо це мертвий корал або скелет. Зразки тканин на Catalaphyllia можна легко отримати за допомогою скальпеля, леза бритви або гострих ножиць. Зразки тканин зазвичай вимагають певного утримання або поводження з коралом, тому, будь ласка, переконайтеся, що ви використовуєте рукавички або асептично очищені руки. Як тільки зразок тканини отримано, його слід негайно помістити у фіксатор і запечатати. Те ж саме стосується цілої колонії, яка була уражена. Колонія просто опускається в фіксатор. Я подбаю про всі подальші кроки, як тільки отримаю його. Кількість необхідної тканини повинна бути не менше 1 см х 1 см і включати щупальця та оральний диск, якщо це можливо, а також більш уражені частини корала. Будь ласка, не надсилайте зразки тканин без фіксації. У морській воді вони швидко псуються і стають непридатними для дослідження. Методи фіксації див. в інструкції до фіксатора.

Фотографування

Я з вдячністю прийму будь-яку фотографічну документацію каталафілії з хворим станом. Це може допомогти просто взяти цифрову камеру в кілька рибних магазинів і зробити кілька фотографій. Я особливо вдячний за фотографічну підтримку коралів, які або відібрані, або надіслані мені живими або зафіксованими. Насправді, я був би дуже радий отримати фотографії до отримання коралового матеріалу, щоб переконатися, що він знаходиться в належному стані. Я також буду вдячний за будь-які додаткові фотографії акваріума в цілому, особливо по відношенню до елегантних коралів. Якщо хтось втратив елегантний корал до такого стану, але зберіг скелет, я хотів би побачити його фотографії з усіх боків і дуже великим планом, якщо камера має таку можливість. Будь ласка, не надавайте фотографії, які розфокусовані або не показують чітко структури або тварин, які фотографуються. Ви можете надіслати цифрові або відскановані зображення на електронну адресу, вказану вище. Я не маю жодних практичних обмежень щодо розміру файлів, і я маю дуже швидкі інтернет-лінії вдома та на роботі, тому не обмежуйте розмір файлу або кількість файлів. Будь ласка, надайте наступну інформацію до кожної фотографії:

Ваше ім’я Дата зйомки Основний опис фотографії Контактна інформація Якщо фотографія супроводжує інші матеріали, що надсилаються, або є окремим фотодокументом.

Я, ймовірно, поставлю інші запитання після отримання фотографій, але поки що цієї інформації достатньо.

Живі корали Будь ласка, використовуйте службу нічної доставки і намагайтеся домовитися про найпізніший можливий час отримання, щоб корали провели якомога менше часу в дорозі. Перш ніж щось відправляти, підтвердьте мені заплановані дати відправлення, щоб я міг бути впевнений, що буду вільний або мати когось доступного. Не надсилайте жодних живих тварин на адресу моєї лабораторії, оскільки можуть бути значні затримки, перш ніж вони потраплять до моєї лабораторії.

Надсилайте всі живі вантажі мені додому. Будь ласка, зв’яжіться зі мною електронною поштою за адресою eborneman@uh.edu для отримання моєї домашньої адреси. Вам не потрібно вимагати звільнення підпису. Всі водії знають мене.

Після підтвердження зі мною отримання вантажу, будь ласка, надішліть мені номер для відстеження на електронну пошту eborneman@uh.edu.

Живі корали повинні бути упаковані в пакети або контейнери і переконатися, що вони не протікають. Настійно рекомендується подвійна упаковка або герметизація контейнерів. Переконайтеся, що коробки добре ізольовані арахісом або пінопластом, а якщо ви відправляєте корали в холодну погоду, переконайтеся, що ви використовуєте тепловий пакет. Рибний магазин, швидше за все, зможе надати їх і відповідну кількість для клімату на той час. Як правило, для невеликих коробок достатньо одного-двох пакетів. Якщо погода надзвичайно холодна (або спекотна), будь ласка, зачекайте, поки не настануть більш помірні умови.

Фіксовані зразки тканин, скелети та інший неживий матеріал

Будь ласка, надсилайте їх регулярною наземною службою за Вашим вибором на наступну адресу і переконайтеся, що якщо в них присутні рідини, особливо спирт або інші фіксатори, що контейнери жорсткі і добре закриті, бажано з кришками, що закручуються, а не защіпками. Якщо ви відправляєте скляну тару, переконайтеся, що коробка добре упакована і прокладена, щоб уникнути розбиття.

Ерік Борнеман Біологічний факультет Х’юстонського університету Науково-дослідний корпус II 4800 Calhoun Rd. Houston, TX 77204 Ph (713) 743-2667

Інструкції з фіксації

Нижче я вставив трохи тексту про фіксацію з Histotechnique для ознайомлення. Метою фіксації є постійне збереження тканин у максимально наближеному до життя стані. Фіксація повинна бути проведена якомога швидше після вилучення тканин або відразу після смерті, щоб запобігти автолізу. Ідеального фіксатора не існує, хоча формальдегід є найбільш близьким до нього. Тому для використання доступні різноманітні фіксатори, залежно від типу наявної тканини та особливостей, які необхідно продемонструвати. Існує загальне використання фіксаторів у патологоанатомічній лабораторії, що базується на природі фіксаторів, типі тканини та гістологічних особливостях, які необхідно продемонструвати.

Формалін використовується для всіх рутинних тканин, коли необхідно виготовити гістологічні препарати. Формалін є найбільш щадним з усіх фіксаторів, коли умови не є ідеальними, і немає тканини, якій він може суттєво зашкодити.

Існує дві основні групи фіксаторів для робіт, необхідних у цьому проекті, класифіковані за механізмом дії:

Альдегіди включають формальдегід (формалін) і глутаральдегід. Тканина фіксується за рахунок поперечних зв’язків, що утворюються в білках, зокрема, між залишками лізину. Таке зшивання не завдає великої шкоди структурі білків, завдяки чому антигенність не втрачається. Формалін добре проникає в тканини, але відносно повільно. Стандартним розчином є 10% нейтральний буферний формалін, хоча для коралових тканин підійде і 10% формалін в морській воді. Існує ряд доступних фіксаторів, які є кращими, включаючи модифікований розчин Хеллі, рецепти параформальдегіду та марку під назвою Z-fix, які особливо добре підходять для коралових тканин. Якщо хтось має доступ до цих хімічних речовин, дайте мені знати електронною поштою, оскільки це було б найкраще для більшості гістологічних аналізів, які я буду використовувати. Я можу надати докладні інструкції, якщо це те, що ви можете зробити.

Глутаральдегід фіксується дуже швидко, тому добре підходить для електронної мікроскопії. Він дуже погано проникає, але дає найкращі загальні цитоплазматичні та ядерні деталі. Стандартним розчином є 2% буферний глутаральдегід. Я не очікую, що мені доведеться робити ЕМ на даному етапі, хоча, можливо, це станеться в майбутньому. Однак я можу використовувати тканини з уражених живих коралів і дуже не хочу, щоб хтось некваліфікований використовував глутаральдегід. Це досить неприємна речовина.

Спирти, включаючи метиловий спирт (метанол) та етиловий спирт (етанол), є денатураторами білків і не використовуються для рутинної обробки тканин, оскільки вони викликають надмірну крихкість і твердість. Спирти, зокрема етанол, використовуються в основному для цитологічних мазків. Етанол (95%) є швидким і дешевим. Оскільки товщина мазків становить лише одну клітину або близько того, немає великої проблеми з усадкою, а оскільки мазки не розрізаються, немає проблеми з індукованою крихкістю. Оскільки коралова тканина має товщину лише два клітинні шари, спирт працює. З тканиною важко працювати пізніше, і деякі аналізи не можуть бути виконані, якщо спирт використовується як фіксатор, але я зможу отримати деякі результати, якщо вони будуть використані. Вони є найбільш доступними для більшості людей. В ідеалі слід використовувати етанол, купуючи невеликі пляшки чистого зернового спирту в винному магазині і розбавляючи його до 70% свіжоприготовленою штучною морською водою. Я б також використовував приблизно 1/4 чайної ложки бікарбонату натрію (харчової соди) в суміші, щоб діяти як буфер, якщо об’єм фіксажу становить близько 250-500 мл (8-16 унцій).

Об’єм фіксатора має важливе значення. Повинно бути співвідношення фіксатора до тканини 10:1. Оскільки корали мають скелет, це необхідно враховувати, оскільки фіксатор буде вбиратися в пористий скелет і не зможе проникнути в тканину корала.

Джерела матеріалів

90% медичний (ізопропіловий) спирт для поверхневої стерилізації доступний у більшості великих аптек.

70% медичний (ізопропіловий) спирт для фіксації та менш ефективної поверхневої стерилізації доступний в аптеках, супермаркетах, цілодобових магазинах тощо.

99-100% етанол доступний у вигляді чистого зернового спирту в алкогольних магазинах. Він часто продається під назвою Everclear. Етанол вартий того, щоб його придбати, хоча він коштує дорожче, ніж медичний спирт. Він є надзвичайно хорошим поверхневим стерилізатором, дуже швидко випаровується, набагато краще підходить для фіксації тканин і є відносно нетоксичним для людини і організмів в акваріумі.

Стерильні тампони, шприци та контейнери можна придбати в деяких аптеках та магазинах лабораторного приладдя. Більшість ветеринарів або ваш лікар, швидше за все, будуть готові розлучитися з деякими з них, якщо ви попросите їх.

Будь ласка, зв’яжіться зі мною електронною поштою для подальших запитів.

Підтримка дослідження

Якщо ви не можете надати кораловий матеріал, але хочете підтримати дослідження, допомігши оплатити витрати, пов’язані з вивченням стану, ви можете зробити пожертвування до Фонду проекту Elegance Coral. Будь ласка, надсилайте пожертви у вигляді чека, грошового переказу або електронного платежу на наступну адресу. Кошти будуть зберігатися та використовуватися за потребою шляхом зняття з рахунку. Будь-які невикористані кошти, що перевищують 10% від загальної суми пожертвування, будуть повернуті, якщо дослідження буде завершено без використання всього фінансування. Повернення 10% від загальної суми пожертвувань буде занадто дорогим і трудомістким, і ці гроші, що залишилися, будуть або збережені для будь-яких майбутніх проектів, або пожертвувані досліднику за його зусилля в проекті, який буде визначений за запитом сторони, що пожертвувала кошти.

Наразі я працюю над створенням фонду і незабаром розміщу інформацію на Кораловому форумі.

Витрати на цей початковий етап проекту будуть безпосередньо пов’язані з кількістю отриманих зразків матеріалу. Витрати на матеріали можуть варіюватися в залежності від того, що вже є в розпорядженні сторони. За моїми оцінками, середні витрати на один зразок становлять:

Source: reefkeeping.com