Селекційна сітка: Вплив впливу міді на розмноження та виживання морських декоративних риб
Селекційна сітка: Вплив впливу міді на розмноження та виживання морських декоративних риб
Це дослідження було проведено для того, щоб визначити, чи може вплив міді спричинити смертність полум’яних рибок-ангелів (Centropyge lorciulus) та вплинути на репродукцію орхідеї крапчастої (Pseudochromis fridmani). Вогняні рибки піддавалися впливу міді в серії експериментів на токсичність. У першому досліді риби-ангели піддавалися впливу міді в концентраціях 0,00, 0,05. 0.10, 0.15, 0.20 та 0.25 мг/л протягом 48 годин (n=5). У другому експерименті риби-ангели піддавалися впливу міді в концентраціях 0,00, 0,10, 0,15 і 0,20 мг/л протягом 196 годин (n=8). У третьому експерименті пари орхідейної крапчатки (n=3) утримували та контролювали репродуктивні показники (частоту нересту, плодючість, коефіцієнт запліднення та виживання личинок, що вилупилися) у воді, що не містила міді (0,00 мг/л), або у воді, обробленій міддю (0,10 мг/л). Результати експериментів з визначення токсичності показали, що полум’яна риба-ангел була дуже чутливою до міді в першому дослідженні, де 60% риб, які зазнали впливу 0,25 мг/л, загинули протягом перших 12 годин після впливу. Аналогічним чином, смертність риб, що зазнали впливу 0,15 та 0,20 мг/л, становила 40%. У другому досліді полум’яна риба-ангел також продемонструвала підвищену смертність (25%) при найвищому досліджуваному рівні (0,20 мг/л), хоча початок смертності в цьому експерименті був відкладений до 120 годин після експозиції. Результати третього експерименту показали, що вплив міді в концентрації 0,10 мг/л значно знизив плодючість і негативно вплинув на ембріональний розвиток маточного матеріалу орхідеї крапчастої. Однак, після заміни на воду, що не містить міді, подальша плодючість, ембріональний розвиток та виживання личинок суттєво не відрізнялися від їхніх значень до впливу. Результати цих комбінованих експериментів показали, що підвищені рівні міді можуть викликати гостру смертність у полум’яних рибок-ангелів і значно знижувати репродуктивні показники маточного стада орхідейної крапчатки. Тому використання міді в якості терапії зовнішніх паразитів у цих видів застерігається.
Вступ
Під час введення в експлуатацію нової лабораторії з розведення морських декоративних риб в Університеті штату Мен, ми пережили епізод гострої смертності майже всього нашого маточного поголів’я полум’яних риб-ангелів у відповідь на те, що, як виявилося, було невстановленим токсином в системі. Раптово одного дня в червні 2004 року було помічено, що наші вогняні риби-ангели неспокійно плавають на поверхні своїх акваріумів, а деякі з них, здавалося, “задихаються”. Більш уважне вивчення всіх наших риб-ангелів показало, що більшість з них демонстрували прискорене дихання, а деякі виглядали млявими. Рибок-ангелів було негайно вилучено з системи і поміщено в нові акваріуми в іншій системі. На жаль, більшість риб загинула від очевидного токсину ще до того, як їх перемістили. Ті риби, які вижили після переміщення, швидко одужали, опинившись у новій воді. Інші види риб у системі (анемони та краснопірка) виглядали нормальними і не зазнали жодних інших наслідків, проте їхні нерестові показники та якість ікри значно знизилися протягом тривалого періоду після цієї події. Після більш ніж двох місяців розслідування ми дійшли висновку, що причиною смертності, ймовірно, був підвищений рівень міді в системі, спричинений випадковим падінням мідного дроту в один з відстійників нашої системи рециркуляції.
About two weeks prior to the incident, an electrical junction box was installed in an area near our main filtration area. Upon inspection of our systems, we found pieces of copper wire insulation and small clippings of mostly dissolved copper wire in the system sump, near the main pump intake. It is likely that these clippings were byproducts of the recent electrical work, and were accidentally dropped into the system. Months after the copper wire was found and removed, the system continued to exhibit an elevated copper level of 0.10 to 0.20mg/L, which is nearly the therapeutic level for treatment of marine fish parasites (Noga, 2000). Since copper was never utilized as a therapy in this system, it was not suspected as a possible toxin and the actual copper level at the time of the fish mortalities was not recorded. Therefore, it is possible that the copper level at the time of the mortality was considerably higher, as we had made several large (>50%) води було замінено в системі одразу після цієї події і до вимірювання рівня розчиненої міді. Залишалося незрозумілим, чому тільки риба-ангел продемонструвала таку гостру реакцію, в той час як інші види в нашій системі виявилися в основному не зачепленими.
Мідь є важливим елементом, необхідним для всіх живих організмів, але вона може бути токсичною для водних видів, коли присутня у підвищених концентраціях (Grossel та ін., 2003, 2004a, 2004b; Handy, 2003). Наприклад, мідь широко використовується як альгіцид і муллуцицид (Paris-Palacios et al., 2000) і часто застосовується для лікування патогенних паразитів риб (Bassleer, 1996; Noga, 2000; Perschbacher, 2005). Хоча токсичність, що виникає внаслідок харчового впливу міді, як правило, виникає лише при дуже високих рівнях, вплив низьких рівнів розчиненої міді у воді для утримання може викликати токсичні ефекти у водних організмів (Grossel et al., 2004a).
В той час як механізми токсичності міді для прісноводних риб вивчені досить детально, про механізми токсичності міді для морських телеотів відомо набагато менше (Grossel et al., 2003). Припускають, що морські риби загалом менш чутливі до впливу міді, що надходить з водою, ніж прісноводні риби (Grossel et al., 2003). Було виявлено, що кальцій і натрій у воді знижують як поглинання міді, так і її токсичність для прісноводних риб, і припускається, що високі концентрації цих іонів у морській воді сприяють зниженню гострої чутливості морських телеотів до міді (Grossel et al., 2003). Підвищення жорсткості води, додавання органічних речовин та збільшення рН також зменшує токсичність міді у прісній воді (Handy, 2003).
Фізіологічний механізм гострої токсичності міді для риб добре відомий (розглянуто в Taylor et al., 1996). Гостра токсичність міді у риб викликана прямим цільовим впливом на зябровий епітелій (Noga, 2000). Гострий вплив міді викликає набряк зябер та підняття епітелію (Handy, 2003). Набряк зябер супроводжується накопиченням розчинених речовин в епітеліальних клітинах і припливом води в клітини, що призводить до втрати іонорегуляторного контролю. Відтік електролітів з крові через зябровий епітелій призводить до серцево-судинної недостатності та смерті (Handy, 2003).
В той час як гострі наслідки токсичності міді добре вивчені, наслідки хронічної токсичності міді недостатньо добре задокументовані (Handy, 2003). Однак було показано, що хронічний (4 тижні або більше) вплив міді може призвести до зміни функцій організму та фізіологічних змін у ряді систем організму. Фізіологічні процеси, на які впливає хронічна експозиція міді, включають зміну типу клітин та їх оборот в епітелії кишечника, зміни в іонорегуляторній фізіології, зміну імунітету, зміну швидкості плавання для збереження метаболічних можливостей аеробного метаболізму, а також зміну репродуктивної стратегії (Handy, 2003).
Цілі даного дослідження полягали в наступному:
- Визначити, чи вплине вплив міді на виживання широко розповсюдженої морської декоративної риби – полум’яної риби-ангела.
- Визначити, чи вплине вплив міді на репродуктивні показники та ембріональний розвиток культивованої морської декоративної риби, орхідеї крапчастої.
У зв’язку з повсюдним використанням міді для лікування зовнішніх паразитів у морській акваріумній індустрії та задокументованим гострим і хронічним впливом міді на риб у поєднанні з нашим несподіваним епізодом з полум’яною рибою-ангелом, ми вважали за необхідне дослідити можливий вплив такого лікування на риб. Наша мета полягала в тому, щоб визначити, чи міг рівень міді, який ми зафіксували після випадку загибелі, спричинити смертність, що спостерігалася, і сприяти зниженню репродуктивних показників інших наших пар риб.
Методи
Експерименти 1 і 2: Вплив впливу міді на виживання полум’яної риби-ангела (Centropyge lorciulus)
Експеримент 1
Першим із серії експериментів з вивчення токсичності міді був 48-годинний експеримент, завершений у червні 2005 року в Океанологічному інституті (ОІ) на Гаваях. У цьому першому дослідженні токсичності міді досліджувався вплив міді на рибу-ангела (Centropyge lorciulus) у концентраціях 0,0, 0,05, 0,10, 0,15, 0,20 та 0,25 мг/л. П’ять екземплярів риб було протестовано в кожній обробці, за винятком контролю, який містив три екземпляри риб. Експеримент проводився в 30 однакових (75 л) акваріумах (рис. 1), по одній рибі на акваріум. Більшість риб, що складали кожну дослідну групу, перебували в ОІ протягом декількох тижнів до початку випробувань і були добре акліматизовані до умов акваріума. Приблизно по дві нові риби в кожну дослідну групу були додані за день до початку експерименту для збільшення кількості повторень. Кожен акваріум мав окремий зовнішній фільтр, а легка аерація забезпечувалася через повітряний камінь у кожному акваріумі. Акваріуми піддавалися впливу навколишнього фотоперіоду (відфільтроване природне сонячне світло), а температура підтримувалася в межах 24-27 °C. Солоність води становила приблизно 32 проміле. Нова морська вода надходила до кожного резервуару зі швидкістю ~25 мл/хвилину (50% заміна на добу). Мідь дозували безпосередньо в резервуари у вигляді сульфату міді з використанням комерційного препарату (Red Sea “Paracure™”), а загальний рівень міді визначали за допомогою колориметричного аналізу (біцинхонінатний метод; Hach #2504025) двічі на день о 09:00 та 15:00 для кожного резервуару за допомогою колориметра Hach™ DR/890. За необхідності мідь повторно дозували для підтримання бажаного рівня лікування. Смертність контролювали щогодини протягом перших 12 годин, а потім кожні 12 годин протягом усього експерименту.
Рисунок 1. Фотографія системи біологічного аналізу в Океанологічному інституті. Кожен резервуар об’ємом 75 л був обладнаний окремим освітленням та фільтрацією і міг працювати як повністю проточний, рециркуляційний або як комбінація обох варіантів.
Експеримент 2
Другий експеримент з визначення токсичності міді був завершений у січні 2006 року з використанням системи біологічного аналізу (рис. 1) в ОІ, але зі зміненою конфігурацією. Використовувалися ті ж самі 75-літрові резервуари, але вони були переобладнані, щоб забезпечити безперервний обмін природної морської води (6 замін резервуарів на добу). Температура підтримувалася на рівні 26-27 °C, а солоність – на рівні 32 проміле. Крім того, до кожного акваріуму було додано нове освітлення та фільтрацію у вигляді витяжки Eclipse™ (Marineland Aquarium Products, Inc.). Система освітлення була налаштована на таймер, що дозволяє 14 годин світла та 10 годин темряви. Було протестовано чотири рівні обробки (0,0, 0,10, 0,15 та 0,20 мг/л міді), по одній рибі на акваріум (n=8). Для цього експерименту вся риба була зариблена одночасно (за 24 години до початку випробувань) і походила від місцевого імпортера морської риби (Hawaiian Sealife Inc, Гонолулу, Гаваї).
Мідь додавали до вхідної морської води у вигляді сульфату міді за допомогою пропорційних змішувальних насосів Dosatron™ (DI 1500), які були підключені до вхідних ліній морської води (1 дозатор на обробку). Щодня готували 100 мг/л розчин міді з використанням дистильованої води та пентагідрату сульфату міді (Fisher Scientific). Цей базовий розчин дозували у вхідні лінії морської води для відповідних груп обробки, щоб підтримувати бажані рівні обробки протягом усього дослідження. Така конфігурація дозволила дуже жорстко контролювати рівні міді, що тестувалися, зберігаючи при цьому відмінну якість води в акваріумах. Загальний рівень міді тестували один раз на день для кожної обробки (n=3 зразки/обробка) за допомогою колориметричного аналізу, як описано для експерименту 1.
Експеримент 3: Вплив впливу міді на розмноження та ембріональний розвиток орхідеї Dottyback (Pseudochromis fridmani)
Умови експерименту та утримання маточного стада
Експеримент проводився в Дослідницькому центрі аквакультури (ARC) в кампусі Університету штату Мен в Ороно, штат Мен. Три пари орхідеї крапчастої (Pseudochromis fridmani) були відібрані з колекції нерестового стада, що утримується комерційною компанією з морської декоративної аквакультури (Sea & Reef Aquaculture, LLC). Кожна пара регулярно нерестилася протягом попереднього року і виробляла численні життєздатні ембріони та личинки. Перед початком експерименту кожна пара була переміщена в ізольований скляний акваріум об’ємом 75 л. Акваріуми були порожніми, за винятком декількох шматків ПВХ труб, які слугували сурогатними “норами” для риб. Температуру води підтримували на рівні 27 ± 1 °C, а солоність – 31 проміле. Фотоперіод становив 14 годин Л: 10 годин Д. Кожен акваріум фільтрувався зануреним ерліфтним губчастим фільтром, який також слугував біофільтрами акваріумів. Параметри якості води перевірялися щодня і підтримувалися на наступних рівнях: pH, 8,1-8,3; NH3, 0,00-0,30 мг/л; NO2, 0,00-0,04 мг/л. Приблизно 25-30% води в резервуарі замінювали щотижня, використовуючи суміш штучної морської води (Forty Fathoms – Crystal Sea) у поєднанні з водою, відфільтрованою методом зворотного осмосу. Нова морська вода перемішувалася та аерувалася протягом 24 годин перед заміною води. Риб годували чотири рази на день комплексним “змішаним” раціоном, що складався з комерційних акваріумних кормів, заморожених креветок мізид та свіжих морепродуктів. Цей режим годівлі був ідентичним до їх попереднього режиму годівлі в якості комерційного маточного поголів’я.
Обробка міддю
Пари утримувались у відповідних акваріумах при 0.00 мг/л Cu протягом 30 днів до обробки міддю (період 1). Мідь (у вигляді сульфату міді) вводили у вигляді комерційно доступного препарату (Red Sea “Paracure™”) у кожен акваріум по 0,10 мг/л протягом 21 дня (період 2). Рівень міді визначали двічі на день у повторних (n=3) 10 мл зразках акваріумної води. Вимірювання міді реєстрували за допомогою колориметричного аналізу з використанням Lamotte “Smart Colorimeter™” з використанням діетлдитіокарбаматного методу (Lamotte №3646-SC). Рівень міді підтримувався на рівні 0,10 ± 0,02 мг/л за допомогою дворазових щоденних доз сульфату міді. Після 21-денного періоду експозиції кожну пару утримували ще 30 днів у воді, що не містить міді (період 3).
Рисунок 2. Серія фотомікрофотографій, що відображає нормальний ембріональний розвиток орхідеї крапчастої (Pseudochromis fridmani). Час = час після запліднення. A 20 хв; B 45 хв; C 90 хв; D 4 год; E 8 год; F 11 год; G 14 год; H 17 год; I 19 год; J 21 год; K 24 год; L 29 год; M 34 год; N 39 год; O 45 год; P 64 год; Q 72 год; R 91 год; S 93 год. Крок комірки на предметному склі = 1 мм.
Процедури відбору проб
Інформація про якість ікри, що включає загальну кількість виробленої ікри, відсоток нормальних ембріонів через 24 години після запліднення, відсоток нормальних ембріонів через 72 години після запліднення, відсоток вилуплення та загальну кількість личинок, що вижили через 12 годин після вилуплення, була зібрана від кожної пари протягом усього експерименту. Три-чотири нерестові цикли були зареєстровані для кожної пари протягом кожного з трьох періодів лікування. За кожною парою проводили щоденне спостереження за відкладанням ікри. Час нересту реєструвався, а ікра вилучалася з резервуару для первинного аналізу приблизно через 24 години після запліднення.
З кожного акваріума вилучали всю ікристу масу і ретельно промакивали насухо безворсовим папером. Потім яєчну масу переносили в градуйований циліндр на 25 мл, що містив відомий об’єм акваріумної морської води. Об’єм води, витіснений ікринною масою, фіксували з точністю до 0,10 мл. Знаючи середній об’єм однієї ікринки, цей метод витіснення (Shirley, неопубл. дані) використовувався для розрахунку приблизної кількості ікринок, вироблених за один нерест. Яєчну масу замінювали після того, як через 24 і 72 години після запліднення відбирали невелику підвибірку яєчної маси (50-100 ікринок) і аналізували її під препарувальним мікроскопом.
Спостерігали за ембріонами на наявність будь-яких аномалій розвитку порівняно з “нормальною” серією розвитку (рис. 2). Реєстрували кількість нормальних та аномальних ембріонів на кожній сесії відбору проб. Увечері очікуваного вилуплення (через 90 годин після запліднення) ікринки були вилучені з акваріума для вилуплення в 8-літровому акваріумі (рис. 3). Яєчну масу помістили в занурену колбу Ерленмейера об’ємом 250 мл і обережно аерували за допомогою жорсткої повітряної трубки зі швидкістю приблизно 40 бульбашок на хвилину. Цей рух сприяв вилупленню яєчної маси після вимкнення світла. Приблизно через 12 годин після вилуплення личинки, що вижили, евтаназували за допомогою MS-222 (100 мг/л) і підраховували.
Рисунок 3. Принципова схема акваріума для інкубації яєць красноперки. Стрілками вказано напрямок потоку повітря/води. Яєчну масу аерували в колбі об’ємом 250 мл, зануреній в акваріум. Верхня частина колби була відкрита, щоб дозволити вилупленим личинкам випливати назовні.
Статистичний аналіз
Всі дані аналізували за допомогою програми SYSTAT™ (ver 11.0). Дані експерименту 3 аналізували за допомогою одностороннього дисперсійного аналізу з повторними вимірами. Нормальність даних (Shapiro and Wilk, 1965) і однорідність дисперсії (Snedecor and Cochran, 1993) були перевірені, щоб переконатися, що припущення для ANOVA були задоволені. Відсоткові дані були перетворені (арксинус) перед проведенням дисперсійного аналізу. Для визначення значущих відмінностей між середніми величинами використовували HSD-тест Тьюкі (Snedecor and Cochran, 1993) (p<0.05).
Результати
Експеримент 1
Середньодобові концентрації міді, виміряні для кожної обробки, та відповідне виживання до 48 годин представлені в таблиці 1. Цільові концентрації міді рідко досягалися, і їх було важко підтримувати на бажаних рівнях лікування протягом більше 8 годин. Як правило, зареєстровані рівні міді були нижче цільових значень вранці та вище цільових значень у другій половині дня після повторного дозування. Крім того, були зафіксовані коливання фонових рівнів міді в морській воді, що надходила до нас, в межах 0,01-0,04 мг/л, що ще більше ускладнювало належне дозування. Незважаючи на коливання рівня міді, риба-ангел була гостро чутливою до міді у вищих дозах. Риба-метелик у групах, які отримували два найвищі рівні міді, демонструвала значну смертність протягом перших 12 годин після впливу.
Рисунок 4. Виживання риби-метелика, що зазнала впливу шести рівнів міді протягом 48 годин (контроль n=3; всі інші n=5).
| Середня концентрація міді | |||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Обробка | День 1 | День 1 | День 2 | День 2 | 3-й день | Середній показник лікування | STDEV | % виживання | |
| мг Cu/л | AM | PM | AM | PM | AM | для тривалості | 48 годин | ||
| 1 n=5 особин для всіх риб, що зазнали впливу міді, n=3 особини для контролю (0,00 мг/л) | |||||||||
| 0.00 | 0.01 | 0.04 | 0.00 | 0.04 | 0.00 | 0.02 | 0.02 | 100% | |
| 0.05 | 0.04 | 0.09 | 0.01 | 0.10 | 0.02 | 0.05 | 0.04 | 100% | |
| 0.10 | 0.04 | 0.14 | 0.06 | 0.15 | 0.04 | 0.08 | 0.06 | 80% | |
| 0.15 | 0.06 | 0.18 | 0.11 | 0.17 | 0.08 | 0.12 | 0.05 | 60% | |
| 0.20 | 0.13 | 0.22 | 0.12 | 0.22 | 0.05 | 0.15 | 0.07 | 60% | |
| 0.25 | 0.18 | 0.26 | 0.12 | 0.26 | 0.16 | 0.20 | 0.06 | 40% | |
Рисунок 5. Залежність виживання полум’яної риби-ангела від підвищеного рівня міді через 48 годин після експозиції. (0,00 мг/л n=3; всі інші n=5)
Взаємозв’язок між тривалістю впливу та смертністю риби-плавунця при підвищенні концентрації міді проілюстровано на рисунку 4. Через 6 годин експозиції при концентрації 0,25 мг/л смертність становила вже 40%. Через 12 годин експозиції при обробці 0,25 мг/л смертність становила 60%, тоді як при обробці 0,20 мг/л та 0,15 мг/л смертність становила 20%. Через 24 години при обробці 0,1, 0,15 та 0,20 мг/л смертність становила ще 20%. Через 36 годин експозиції кумулятивна смертність досягла свого максимального значення і залишалася постійною до завершення експерименту о 48 годині. Всі риби, які отримували 0,00 мг/л (n=3) та 0,05 мг/л (n=5), пережили випробування. Результати лог-рангового (Мантел-Кокс) порівняння кривих виживання виявили достовірну різницю (p<0.05) between the slopes of the 0.25mg/L and Control treatment curves. These data indicated that copper toxicity increased with increasing concentration and that mortality was strongly correlated with copper level. Figure 5 illustrates the relationship between the copper levels recorded and mortality in flame angelfish at the conclusion of this experiment.
Експеримент 2
Рисунок 6. Зареєстровані рівні міді під час дослідження Експеримент 2. Рівні міді вимірювали один раз на день у трьох повторних зразках, значення представлені як середнє значення ± стандартне відхилення.
Рівні міді підтримувалися на контрольованому рівні в досліді 2 і не мали значних коливань від цільових рівнів лікування (рис. 6). Однак, через використання Dosatron™ у конфігурації з проточною морською водою, рівні міді досягли цільових концентрацій лише через 24 години. Ми регулярно вимірювали значення між 0,02-0,05 мг/л міді в контрольній обробці, що вказує на фоновий рівень міді в нашій вхідній вихідній воді. Ці фонові значення були подібні до тих, що спостерігалися в експерименті 1 (Таблиця 1).
Виживання полум’яної риби-ангела, що зазнала впливу 4-х рівнів міді, показано на Рисунку 7. На відміну від того, що спостерігалося в експерименті 1, смертність не спостерігалася до 5 днів після впливу найвищого рівня (0,20 мг/л). Після 144 годин впливу (6-й день) при обробці 0,20 мг/л смертність становила 25%. Жодної додаткової смертності не спостерігалося протягом усього експерименту. Жодна з інших груп лікування не зазнала жодної смертності.
Експеримент 3
Узагальнені дані, зібрані під час експерименту 3, представлені в таблиці 2. Протягом 30-денного періоду попередньої обробки кожна пара краснопірки нерестилася від чотирьох до п’яти разів. Середня кількість ікринок за один нерест (n=14) становила 1927 ± 122, а середня кількість вилуплених личинок, підрахованих через 12 годин після вилуплення, – 730 ± 135. Нормальність ембріонів, що розвивалися, становила 98% та 84% через 24 години та 72 години, відповідно. Ембріональний розвиток наближався до нормального розвитку, як показано на рисунку 2. Середній показник вилуплення становив 46%. Важливо відзначити, що ми вважаємо, що на рівень вилуплення негативно вплинула штучна інкубація яєчної маси, оскільки типовий рівень вилуплення зазвичай становить близько 100%, коли яєчну масу залишали під наглядом самця. Незважаючи на всі наші зусилля, спрямовані на відтворення руху та середовища виведення яєчної маси, ми зазвичай не могли досягти виведення вище 70%.
Рисунок 7. Виживання полум’яної риби-ангела, що зазнала впливу міді протягом 168 годин. Рівні лікування були досягнуті лише через 24 години після дозування (n=8 риб на обробку).
| Період | # Нерест | Ікра/плідник | Норма 24 години % Норма 24 години % Норма 72 години % Норма 72 години % Норма | Нормально через 72 години | Личинки, що вилупилися | Відсоток вилуплення личинок | |
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Значення є середніми ± стандартна похибка. | |||||||
| Пара 1 | Pre-Cu | 4 | 2365 ± 203 | 97.37 ± 1 | 96.90 ± 2 | 1107 ± 46 | 54.07 ± 6 |
| Пара 2 | Pre-Cu | 5 | 2013 ± 96 | 98.72 ± 1 | 93.89 ± 2 | 941 ± 91 | 49.12 ± 8 |
| Пара 3 | Pre-Cu | 5 | 1491 ± 122 | 99.13 ± 1 | 60.97 ±23 | 376 ± 193 | 33.59 ± 19 |
| Пара 1 | Протягом Cu | 4 | 1305 ± 66 | 56.73 ± 9 | 0 | 0 | 0 |
| Пара 2 | Протягом Cu | 3 | 963 ± 296 | 49.26 ± 10 | 0 | 0 | 0 |
| Пара 3 | Протягом Cu | 2 | 746 ± 186 | 37.78 ± 7 | 0 | 0 | 0 |
| Пара 1 | Після Cu | 3 | 2641 ± 55 | 95.30 ± 2 | 91.58 ± 3 | 1734±433 | 69.76 ±18 |
| Пара 2 | Після Cu | 4 | 1608 ±70 | 72.80 ±18 | 53.36 ± 22 | 497 ±316 | 32.29 ±20 |
| Пара 3 | Після Cu | 0 | N/A | N/A | N/A | N/A | N/A |
Рис. 8. (Вгорі) Середня кількість отриманих яєць та вилуплених личинок і (внизу) середній відсоток нормальних ембріонів через 24 та 72 години після запліднення, до, під час та після обробки міддю. Значення представлені як середні значення (n=3 пари) ± стандартна похибка. Зірочка вказує на достовірну різницю між середніми значеннями (p<0.05).
Більшість відхилень, спричинених обробкою міддю, були помітні через 24 години після запліднення (рис. 9). Вплив міді на досліджуваних рівнях спричинив зупинку багатьох ембріонів, що розвиваються, незабаром після запліднення. Ці зупинені ембріони починали темніти в міру того, як вони розкладалися всередині яйця. Багато яєць виглядали менш круглими, а в деяких випадках були повністю деформовані.
Незважаючи на велику кількість аномалій, що спостерігалися через 24 години після запліднення, багато ембріонів продовжували розвиватися приблизно до 30-40 годин після запліднення. Через 72 години після запліднення було зрозуміло, що майже жоден (<1%) of the embryos exposed to copper sulfate had survived (Fig. 10).
Через те, що ми дозволили самцю доглядати за яйцевою масою безпосередньо перед вилупленням, дуже мало яєць було доступно для відбору проб через 72 години після обробки міддю. Зазвичай самець відбирає мертві або неправильно розвинені яйця під час інкубаційного періоду, тим самим зменшуючи кількість ембріонів, які ми змогли оцінити. Однак з яєць, що залишилися для відбору проб, ми все ж змогли задокументувати аномальний розвиток ембріонів, що зазнали впливу міді (рис. 10). Виявилося, що більша частина розвитку припинилася через 40 годин після запліднення, незважаючи на нормальний розвиток до цього моменту. Були дуже невеликі (<1%) number of embryos that completed normal development to 72 hours post-fertilization. However, the male had consumed, or otherwise culled out, all remaining eggs from his den prior to the 90hr post-fertilization point when we would normally remove the egg mass for hatching. Therefore, there were no eggs available for hatching, resulting in zero hatched larvae during the copper treatment period.
Малюнок 9. Фотографії аномалій раннього ембріонального розвитку яйцеклітин орхідеї крапчатки, що зазнали впливу міді. Стрілками вказані нормальні ембріони. А) Нормальний ембріон через 24 години після запліднення, оточений мертвими (темними) і деформованими яйцями. B) Крупний план затриманого 24-годинного ембріона після запліднення, що показує характерне потемніння області жовтка. C) Нормальний ембріон через 24 години після запліднення з ембріоном, який зупинився через 10-12 годин після запліднення. D) Нормальний ембріон через 24 години після запліднення, оточений ембріонами, які зупинилися через 4-8 годин після запліднення.
Протягом 30-денного періоду відновлення (період 3) пара №1 та №2 віднерестилася три та чотири рази відповідно. Середня кількість ікринок, отриманих за один нерест (n=7), становила 2050 ± 204, а середня кількість вилуплених личинок, підрахованих через 12 годин після вилуплення, становила 1027 ± 318. Нормальність ембріонів, що розвивалися, становила 82% та 69% через 24 години та 72 години, відповідно. Ембріональний розвиток наближався до нормального розвитку, як показано на рисунку 2. Середній показник вилуплення становив 48%. Всі дані про нерест, зібрані в період після лікування, суттєво не відрізнялися від даних до лікування. Однак пара 3 не відновила нерест протягом 30-денного періоду спостереження після лікування. Невідомо, чому вони не відновили нерест, оскільки всі інші спостережувані ознаки поведінки були в нормі.
Обговорення
Влітку 2004 року спостерігалася гостра смертність маточного поголів’я полум’яного риба-ангела та поступове, але загальносистемне зниження репродуктивних показників (вихід ікри та її життєздатність) у низки інших видів (риба-клоун та крапчастий окунь). Після тривалих досліджень було встановлено, що єдиним ненормальним параметром системи був підвищений рівень міді, спричинений введенням мідного дроту у відстійник рециркуляційної системи утримання. Дріт повільно розчинявся, вивільняючи мідь у воду, і врешті-решт підвищив рівень міді в системі до 0,10-0,20 мг/л. Минуло щонайменше 6 тижнів, перш ніж було виявлено підвищений рівень міді.
Після значних зусиль мідь було видалено з системи за допомогою серії великих підмін води, видалення всього субстрату карбонату кальцію (який поглинав мідь, діючи як мідна губка, згодом знову вивільняючи мідь назад у воду для досягнення рівноваги), а також за допомогою наявної у продажу смоли для видалення міді Cuprisorb™ (Seachem Laboratories, Inc.). Як тільки рівень міді знизився до рівня нижче 0,10 мг/л, більшість пар плідників знову почали нормально нереститися.
Рисунок 10. Фотографії аномалій пізнього ембріонального розвитку ікринок орхідеї крапчатки, що зазнали впливу міді. Стрілками вказані нормальні ембріони. А) Крупний план затриманих ~35-годинний ембріон після запліднення, що показує потемніння жовтка та вигнуту вісь тіла. Б) Нормальний ембріон через 72 години після запліднення поруч з ембріоном, який зупинився через 30-40 годин після запліднення.
Використання міді для лікування морських паразитів вимагає постійного впливу на рівні 0,15-0,25 мг/л протягом щонайменше 21 дня (Bassleer, 1996; Noga, 2000). Враховуючи продемонстровану чутливість риби-ангела до міді, лікування міддю протипоказане для цього виду. На відміну від риб, які піддавалися обробці низькими рівнями, риби, які піддавалися обробці найвищими рівнями (експеримент 1), зазнали негайного негативного впливу від додавання міді у воду. Вже через кілька годин після впливу багато риб у групах з високим вмістом міді демонстрували ознаки стресу (прискорене дихання та нестабільна поведінка під час плавання). Поведінка, що спостерігалася під час цих обробок, була дуже схожа на ту, що спостерігалася під час гострої смертності в АРК в штаті Мен. Було очевидно, що додавання міді у воду в рекомендованих терапевтичних концентраціях викликало сильний стрес і травми у цих риб.
До початку експерименту 1 було зафіксовано загибель двох нещодавно придбаних риб. Ці дві риби були помічені з ознаками “стресу” (прискорене дихання та ненормальна поведінка під час плавання) після прибуття в ОІ. Їх цілеспрямовано збиралися віднести до групи лікування 0,00 мг/л з думкою, що будь-який додатковий “стрес” від лікування може ненавмисно спричинити смертність, змішуючи ефекти лікування міддю. Однак, смертність цих риб до початку експерименту призвела до того, що випробування було розпочато лише з 3 екземплярів у контрольній групі.
Таку смертність можна пояснити стресом, який зазнала риба, коли її нещодавно завезли. Єдиними загиблими рибами з контрольної групи були нові риби, придбані незадовго до початку експерименту. Акліматизаційний стрес і подальша смертність, на жаль, є поширеним явищем для новопридбаної риби. Смертність особливо поширена серед риб, які були нещодавно виловлені, як це, безсумнівно, було (надходження безпосередньо від імпортера). Решта риб у контрольній групі не мали видимих ознак стресу і виглядали абсолютно нормальними протягом усього випробування. Крім того, інші новопридбані риби не внесли непропорційного внеску в спостережувану смертність в інших групах лікування. Крім того, риби-ангели, які отримували 0,05 мг/л, не зазнали жодної смертності, що свідчить про те, що цей вид не повинен зазнавати негативного впливу при фонових рівнях міді, які регулярно вимірюються в солоній воді, що надходить до Океанологічного інституту (зі свердловин).
В експерименті 2 не було зафіксовано такого ж гострого початку смертності після впливу міді. Однак, у риби-ангела при найвищому рівні обробки спостерігалася 25% смертність. Можливо, що завдяки більш поступовому та постійному додаванню міді ці риби змогли дещо акліматизуватися до більш високих рівнів міді. Більш імовірно, що, оскільки ці риби стають все більш чутливими до міді на більш високих рівнях обробки, зменшення коливань у дозуванні міді запобігло впливу цих “верхніх максимумів”. В експерименті 1 цільові рівні обробки часто перевищувалися в другій половині дня, піддаючи рибу (навіть якщо тільки на годину або дві) впливу більш високих рівнів, ніж бажані. Цей вплив, ймовірно, міг призвести до посилення стресу та зниження здатності справлятися з міддю на нижчих рівнях та/або здатності пристосовуватися до коливань міді. Однак перший метод дозування міді (без використання дозуючого обладнання) є єдиним можливим методом для любителів.
Тривалий вплив міді зі зниженою смертністю може бути можливим при використанні проточної системи з дозуючим обладнанням, наприклад, описаної в експерименті 2. Таким чином можна досягти точного дозування міді на цільових терапевтичних рівнях. Однак впровадження таких систем, ймовірно, виходить за рамки можливостей більшості любителів, імпортерів або власників роздрібної торгівлі. Крім того, невідомо, чи призвела б тривала експозиція після тижневої кінцевої точки цього дослідження до додаткової хронічної смертності. Також можливо, що повторний або тривалий вплив міді може спричинити інші, менш очевидні фізіологічні ушкодження. Тому слід дослідити альтернативні стратегії лікування для лікування зовнішніх паразитів у цього виду риб.
Результати експерименту 3 підтверджують, що найнижчий рівень міді, який спостерігався в період аварійного внесення міді (0,10 мг/л), був достатньо високим, щоб погіршити відтворення маточного стада морських декоративних риб. Вплив міді на розмноження морських декоративних риб має подвійний характер, негативно впливаючи як на дорослих особин, так і на ембріони. По-перше, мідь у концентрації 0,10 мг/л впливала на дорослих самок орхідеї крапчастої, про що свідчило значне зменшення кількості ікринок. По-друге, той самий рівень міді був токсичним для ембріонів крапчастої орхідеї, що розвивалися, оскільки жоден з ембріонів не вижив після 48 годин експозиції. Цікаво відзначити, що хоча мідь впливала на дорослих самок, дорослі самці, схоже, не зазнали впливу в тій же мірі, про що свідчить незмінний рівень запліднення яєць під час впливу міді. Рівень запліднення залишався близько 100% протягом усього періоду дослідження і, схоже, не залежав від рівня міді у воді. Було помічено, що ікринки, отримані в обробленій міддю воді, якщо їх перенести у воду, що не містить міді, незабаром після запліднення, завершують нормальний ембріональний розвиток. Цей результат свідчить про те, що негативний вплив міді на ембріон, що розвивається, мав місце після запліднення і був спричинений впливом міді у воді, а не впливом всередині самки під час дозрівання яйцеклітини.
Хоча вплив міді погіршив розмноження та ембріональний розвиток цього виду, ці ефекти були зворотними незабаром після повернення риб у воду, що не містить міді. Після лікування дві з трьох пар негайно почали виробляти ікру та личинок у кількості, аналогічній до рівня до лікування. Хоча третя пара не відновила нерест протягом 30-денного періоду оцінки після впливу, незабаром після цього вона знову почала нереститися. Ці результати вказують на те, що помірний вплив міді може не мати негативного довготривалого впливу на розмноження морських декоративних риб. Однак слід бути обережними при терапевтичному застосуванні міді, оскільки деякі види, такі як полум’яна риба-ангел, виявляються набагато чутливішими, ніж інші. З цих результатів можна зробити висновок, що зафіксовані рівні міді, які спостерігалися в системі в АРК, могли сприяти смертності полум’яної риби-ангела та тривалому зниженню репродуктивної здатності інших морських декоративних риб. Мідь також виявилося дуже важко видалити з рециркуляційних систем, і тому її слід уникати, якщо є інші життєздатні альтернативи очищення.
Подяки
Дякуємо Сьорену Хансену за допомогу у виявленні та усуненні забруднення міддю нашої системи маточного стада. Ми хочемо подякувати доктору Майклу Оптізу за підготовку зразків тканин та допомогу в діагностиці токсичності міді. Додаткові умови для заміни маточного поголів’я та модифікації систем були надані Університетом штату Мен. Ми також хочемо подякувати Кеннету Лю та Джо Айпі за допомогу в проведенні аналізів на токсичність міді в Океанологічному інституті. Фінансування аналізів токсичності риби-ангела було надано в рамках Проекту сталого розвитку рибальства на Гаваях (грант NOAA № NA05NM4441228).
Список використаних джерел
- Алі, А., Аль-Огайлі, С.М., Аль-Асгах, Н.А., Гропп, Д., 2003. Вплив сублетальних концентрацій міді на показники росту Oreochromis niloticus. Журнал прикладної іхтіології 19, 183-188.
- Басслер, Г., 1996. Хвороби морських акваріумних риб: причини, симптоми лікування. Basleer Biofish, Westmeerbeek, Бельгія. 94p.
- Grossel, M., Hansen, H.J.M., Rosenkilde, P., 1998. Поглинання, метаболізм та елімінація міді у ситих та голодних європейських вугрів (Anguilla Anguilla) під час адаптації до впливу міді, що переноситься водним шляхом. Порівняльна біохімія і фізіологія, частина С. 120, 295-305.
- Гроссел, М., Макдональд, М.Д., Уолш, П.Д., Вуд, К.М., 2004. Ефекти тривалого впливу міді у морської затокової жаби (Opsanus beta) II: накопичення міді, швидкість пиття та активність Na+/K+-АТФази в осморегуляторних тканинах. Водна токсикологія 68, 263-275.
- Grossel, M., McDonald, M.D., Wood, C.M., Walsh, P.J. 2004. Ефекти тривалого впливу міді на морську затокову жабу (Opsanus beta) I. Гідромінеральний баланс та азотисті відходи плазми. Водна токсикологія 68, 249-262.
- Гроссел, М., Вуд, К.М., Уолш, П.Д., 2003. Гомеостаз міді та токсичність у елазмобранча Raja erinacea та телеоста Myoxocephalus octodecemspinosus під час впливу підвищеного вмісту міді у воді. Порівняльна біохімія і фізіологія, частина С. 135, 179-190.
- Handy, R., 2003. Хронічні ефекти впливу міді проти ендокринної токсичності: дві сторони одного токсикологічного процесу? Порівняльна біохімія і фізіологія, частина А. 135, 25-38.
- Noga, E.J., 2000. Хвороби риб: Діагностика та лікування. Blackwell Publishing.Ames, Iowa. 367p.
- Paris-Palacios, S., Biagianti-Risbourg, G., Vernet, G., 2000. Біохімічні та (ультра) структурні порушення печінки Brachydanio rerio (Teleostei, Cyprinidae), що зазнали впливу двох сублетальних концентрацій сульфату міді. Водна токсикологія 50, 109-124.
- Perschbacher, P.W., 2005. Вплив температури на гостру токсичність міді для молоді канального сома Ictalurus punctatus. Аквакультура 243, 225-228.
- Шапіро, С.С., Вілк, М.Б., 1965. Дисперсійний аналіз на нормальність (повні вибірки). Біометрика 52, 591-611.
- Snedecor, G. W., Cochran, W. G., 1993. Тест Левена на однорідність дисперсії. В кн: Статистичні методи, 8-е видання. Видавництво Університету штату Айова, Еймс, Айова.
Source: reefs.com