Гіперзмінний алодетермінант безхребетних

Колоніальні морські безхребетні, такі як губки, корали, моховатки та асцидії, часто живуть у густонаселених спільнотах, де вони стикаються з іншими представниками свого виду, коли ростуть над своїм субстратом. Такі зустрічі зазвичай призводять до природної реакції гістосумісності, при якій колонії або зливаються, перетворюючись на єдину химерну колонію, або відторгаються і агресивно конкурують за простір. Ці явища алорозпізнавання опосередковують внутрішньовидову конкуренцію [

• Francis L.

Внутрішньовидова агресія та її вплив на поширення Anthopleura elegantissima та деяких споріднених морських анемон.

Biol. Bull. 1973; 144 : 73-92

• Buss L.W.
• Гросберг Р.К.

Морфогенетичні основи фенотипових відмінностей у конкурентній поведінці гідробіонтів.
Природа. 1990; 343 : 63-66

• Buss L.W.

Конкуренція всередині та між інкрустуючими клональними безхребетними.
Тенденції екол. Evol. 1990; 5 : 352-356
], підтримувати алотипічне різноманіття [

• Гросберг Р.К.

The evolution of allorecognition specificity in clonal invertebrates.
Q. Rev. Biol. 1988; 63 : 377-412
], контролювати рівень, на якому діє відбір [

• Stoner D.S.
• Rinkevich B.
• Weissman I.L.

Спадкова конкуренція зародкових і соматичних клітинних ліній у химерних колоніальних протохордових.
Доповіді. Natl. Acad. Sci. USA. 1999; 96 : 9148-9153

• Buss L.W.

Паразитизм соматичних клітин і еволюція сумісності соматичних тканин.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1982; 79 : 5337-5341

• Buss L.W.

Еволюція індивідуальності.
Princeton University Press, Princeton, NJ 1987

• Laird D.J.
• De Tomaso A.W.
• Weissman I.L.

Стовбурові клітини – одиниці природного добору в колоніальній асцидії.
Клітина. 2005; 123 : 1351-1360
], і нагадують алогенні взаємодії при вагітності та трансплантації [

• Burnet F.M.

“Саморозпізнавання” у колоніальних морських форм і квіткових рослин у зв’язку з еволюцією імунітету.

Природа. 1971; 232 : 230-235

• De Tomaso A.W.
• Nyholm S.V.
• Palmeri K.J.
• Ishizuka K.J.
• Ludington W.B.
• Mitchel K.
• Weissman I.L.

Виділення та характеристика локусу гістосумісності протохордових.
Природа. 2005; 438 : 454-459

• Litman G.W.
• Cannon J.P.
• Dishaw L.J.

Реконструкція імунного філогенезу: нові перспективи.
Нат. Rev. Immunol. 2005; 5 : 866-879

• Laird D.J.
• De Tomaso A.W.
• Cooper M.D.
• Weissman I.L.

50 мільйонів років еволюції хордових: у пошуках витоків адаптивного імунітету.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000; 97 : 6924-6926

]. Однак, незважаючи на повсюдне поширення алорозпізнавання в колоніальних філах, його молекулярна основа не була ідентифікована за межами того, що на сьогодні відомо про гістосумісність у хребетних і протохордових тварин. Ми позиційно клонували ген алорозпізнавання, використовуючи інбредні штами кишковопорожнинних Hydractinia symbiolongicarpus, які є модельною системою для вивчення алорозпізнавання безхребетних. Виявлений ген кодує ймовірний трансмембранний рецептор, що експресується у всіх тканинах, здатних до алорозпізнавання, який є високополіморфним і прогнозує реакції алорозпізнавання у лабораторних та польових штамів. Це дослідження показує, що раніше неописана гіперваріабельна молекула, яка містить три позаклітинні домени з найбільшою послідовністю, подібною до суперсімейства імуноглобулінів, є алодетермінантом у нижчих метазоан.

Результати та обговорення

Колонії Hydractinia складаються з поліпів, спеціалізованих для харчування, розмноження або захисту, які відбруньковуються від мату, листа з двох шарів ектодермальних клітин, які оточують мережу ендодермальних гастроваскулярних каналів (Рис. 1А). Колонії ростуть шляхом розширення переднього краю килимка або шляхом подовження столонів, ектодермально покритих розширень шлунково-судинних каналів. Коли дві колонії Hydractinia контактують, вони піддаються реакції злиття-відторгнення. Злиття характеризується ектодермальною адгезією клітин і створенням безперервної гастроваскулярної системи [

• Buss L.W.
• McFadden C.S.
• Keene D.R.

Біологія гідрактінієвих гідроїдів. 2. Конкурентний механізм ефекторної системи гістосумісності, опосередкований виділеннями нематоцист.

Biol. Бюл. 1984; 167 : 139-158

• Lange R.
• Plickert G.
• Müller W.A.

Гістонесумісність у низьких безхребетних, Hydractinia echinata: аналіз механізму відторгнення.

J. Exp. Zool. 1989; 249 : 284-292

) (рис. 1Б та 1В). На противагу цьому, відторгнення характеризується нездатністю ектодермальних клітин до адгезії та екстенсивним рекрутуванням нематоцитів до місця контакту [

• Buss L.W.
• McFadden C.S.
• Keene D.R.

Біологія гідрактінієвих гідроїдів. 2. Конкурентний механізм ефекторної системи гістосумісності, опосередкований виділеннями нематоцист.

Biol. Бюл. 1984; 167 : 139-158

• Lange R.
• Plickert G.
• Müller W.A.

Гістонесумісність у низьких безхребетних, Hydractinia echinata: аналіз механізму відторгнення.

J. Exp. Zool. 1989; 249 : 284-292

]. Нематоцити – це специфічний для кишковопорожнинних тип клітин, який містить нематоцисти, гарпуноподібні органели, що використовуються для живлення та захисту. Нематоцити в місці контакту спочатку не вивільняють свої нематоцисти, а збираються на краю колонії (рис. 1D) і одночасно вистрілюють після контакту, руйнуючи чужорідну тканину. Додаткові нематоцити згодом мігрують в зону контакту і вивільняють свої нематоцисти, як тільки вони орієнтуються на протилежну колонію [

• Lange R.
• Plickert G.
• Müller W.A.

Гістонесумісність у низьких безхребетних, Hydractinia echinata: аналіз механізму відторгнення.

J. Exp. Zool. 1989; 249 : 284-292

]. Під час реакції відторгнення столони часто стають гіперпластичними, набухають нематоцитами, відриваються від субстрату і розростаються над протилежною колонією (рис. 1E і 1F) [

• Buss L.W.
• McFadden C.S.
• Keene D.R.

Біологія гідрактінієвих гідроїдів. 2. Конкурентний механізм ефекторної системи гістосумісності, опосередкований виділеннями нематоцист.

Biol. Бюл. 1984; 167 : 139-158

• Lange R.
• Plickert G.
• Müller W.A.

Гістонесумісність у низьких безхребетних, Hydractinia echinata: аналіз механізму відторгнення.

J. Exp. Zool. 1989; 249 : 284-292

• Івкер Ф.Б.

Ієрархія гістонесумісності у Hydractinia echinata.
Біол. Бюл. 1972; 143 : 162-174

Дослідження генетики алорозпізнавання у Hydractinia розпочалися в 1950-х роках, коли Hauenschild [ Hauenschild C.

• Hauenschild C.

Über die Vererbung einer Gewebeverträglichkeitseigenschaft bei dem Hydroidpolypen Hydractinia echinata .

Z Naturforsch Pt B. 1956; 11 : 132-138

• Hauenschild C.

Genetische und entwichlungphysiologische Untersuchungen über Intersexualität und Gewebeverträlichkeit bei Hydractinia echinata Flem.

Rouxs Arch. Dev. Biol. 1954; 147 : 1-41

] проводив систематичні селекційні експерименти, в яких він створив дві популяції F₂ популяції, отримані з двох окремих пар колоній дикого типу. Він інтерпретував результати цих схрещувань за допомогою однолокусної моделі успадкування, але зазначив, що ця модель не пояснює невелику частку результатів злиття в популяціях F₁ і F₂ поколіннях. Пізніші дослідники аналогічним чином повідомляли про результати зчеплення, що не узгоджуються з простим однолокусним менделівським успадкуванням у F₁ і F₂ популяцій, отриманих з колоній дикого типу [

• Гросберг Р.К.
• Levitan D.R.
• Cameron B.B.

Еволюційна генетика алорозпізнавання у колоніальних гідроїдних Hydractinia symbiolongicarpus.
Evolution Int. J. Org. Evolution. 1996; 50 : 2221-2240

]. Згодом у нашій лабораторії було створено інбредні лінії Hydractinia і показано, що в цих лініях алорозпізнавання сегрегує у вигляді пари тісно зчеплених локусів alr1 і alr2, які картовані на хромосомному інтервалі 1,7 сМ [

• Mokady O.
• Buss L.W.

Генетика передачі алорозпізнавання у Hydractinia symbiolongicarpus (Cnidaria:Hydrozoa).
Генетика. 1996; 143 : 823-827

• Cadavid L.F.
• Powell A.E.
• Nicotra M.L.
• Moreno M.
• Buss L.W.

Комплекс гістосумісності безхребетних.
Генетика. 2004; 167 : 357-365

• Powell A.E.
• Nicotra M.L.
• Moreno M.A.
• Lakkis F.G.
• Dellaporta S.L.
• Buss L.W.

Диференційний вплив алорозпізнавальних локусів на фенотип у Hydractinia symbiolongicarpus (Cnidaria: Hydrozoa).

Генетика. 2007; 177 : 2101-2107

(рис. 2А). У наших інбредних штамів у кожному локусі сегрегують два алелі (f і r). Колонії, що мають принаймні один алель в обох локусах, зливаються, тоді як колонії, що не мають жодного алеля в жодному з локусів, відкидаються. Колонії, що мають спільні алелі тільки в одному локусі, піддаються транзиторному злиттю, яке може бути двох типів [

• Cadavid L.F.
• Powell A.E.
• Nicotra M.L.
• Moreno M.
• Buss L.W.

Комплекс гістосумісності безхребетних.
Генетика. 2004; 167 : 357-365

• Powell A.E.
• Nicotra M.L.
• Moreno M.A.
• Lakkis F.G.
• Dellaporta S.L.
• Buss L.W.

Диференційний вплив алорозпізнавальних локусів на фенотип у Hydractinia symbiolongicarpus (Cnidaria: Hydrozoa).

Генетика. 2007; 177 : 2101-2107

]. Якщо колонії мають хоча б один алель за alr2 і жодного за alr1, вони спочатку зливаються, але через 1-3 дні після злиття утворюється сіра смуга в зоні контакту, їх гастроваскулярні канали закупорюються, і вони остаточно роз’єднуються протягом 1-3 днів (транзиторне злиття I типу) [

• Cadavid L.F.
• Powell A.E.
• Nicotra M.L.
• Moreno M.
• Buss L.W.

Комплекс гістосумісності безхребетних.
Генетика. 2004; 167 : 357-365

• Powell A.E.
• Nicotra M.L.
• Moreno M.A.
• Lakkis F.G.
• Dellaporta S.L.
• Buss L.W.

Диференційний вплив алорозпізнавальних локусів на фенотип у Hydractinia symbiolongicarpus (Cnidaria: Hydrozoa).

Генетика. 2007; 177 : 2101-2107

]. На противагу цьому, колонії, які мають принаймні один алель в alr1 і жодного в alr2, нормально зливаються протягом 1-4 днів, а потім демонструють цикли поділу та відмови, які тривають невизначено довго (транзиторне злиття типу II) [ Powell E.A.

• Powell A.E.
• Nicotra M.L.
• Moreno M.A.
• Lakkis F.G.
• Dellaporta S.L.
• Buss L.W.

Диференційний вплив алорозпізнавальних локусів на фенотип у Hydractinia symbiolongicarpus (Cnidaria: Hydrozoa).

Генетика. 2007; 177 : 2101-2107
]. Таким чином, alr1 та alr2 спільно відрізняють себе від не-себе.

Позиційне клонування та ідентифікація гена-кандидата alr2

Ми позиційно клонували alr2 за допомогою тісно зчепленого молекулярного маркера (маркер 174, рис. 2Б) [

• Cadavid L.F.
• Powell A.E.
• Nicotra M.L.
• Moreno M.
• Buss L.W.

Комплекс гістосумісності безхребетних.
Генетика. 2004; 167 : 357-365

]. Бактеріальні штучні хромосомні (БАК) та фосмідні геномні бібліотеки були сконструйовані з лабораторного штаму, гомозиготного за алелем f як за alr1, так і за alr2 (колонія 833-8). Нами були використані раніше ідентифіковані рекомбінанти [

• Cadavid L.F.
• Powell A.E.
• Nicotra M.L.
• Moreno M.
• Buss L.W.

Комплекс гістосумісності безхребетних.
Генетика. 2004; 167 : 357-365

• Powell A.E.
• Nicotra M.L.
• Moreno M.A.
• Lakkis F.G.
• Dellaporta S.L.
• Buss L.W.

Диференційний вплив алорозпізнавальних локусів на фенотип у Hydractinia symbiolongicarpus (Cnidaria: Hydrozoa).

Генетика. 2007; 177 : 2101-2107

Для визначення проксимальних та дистальних меж локусу alr2 з шістьма рекомбінаційними точками розриву, локалізованими в двох ділянках розміром ∼15 кб на кожному кінці контигату (Х, рис. 2Б), було використано методику, що дозволяє визначити проміжні та дистальні межі локусу alr2.)

Мінімальний шлях плиткоутворення над ділянкою alr2 був секвенований та проаналізований на наявність передбачуваних кодуючих послідовностей (CDS), яких ми ідентифікували дев’ять (Рисунок 2B та Таблиця S1, доступні в Інтернеті). Для кожної CDS ми отримали повнорозмірну послідовність кДНК та проаналізували експресію за допомогою RT-PCR. Пошук подібності, порівнюючи кожен передбачуваний CDS з базами даних білків та консервативних доменів, визначив ці гени як ймовірні гомологи малатдегідрогенази Nematostella (CDS1), гіпотетичного білка комара, що містить анкіринові повтори та РНК-зв’язуючий домен KH (CDS2), білка, пов’язаного з актином великої рогатої худоби 8 (CDS3), фактора 2 збірки мітохондріального комплексу F1 АТФ-синтази курки (CDS4) та альфа-1,6-фуксозилтрансферази медоносної бджоли (CDS8). Для CDS7 перше BLAST-співпадіння було з білком невідомої функції з нематоди Brugia malayi, в той час як CDS9 не був схожий на жоден відомий білок. Дві інші послідовності, CDS5 і CDS6, були частковими дублікатами CDS7 (Рис. S1). Хоча продукти кДНК для CDS5 і CDS6 були ампліфіковані за допомогою 5′ RACE, експерименти з 3′ RACE з тими ж пулами кДНК, які успішно використовувались у всіх інших експериментах RACE, неодноразово зазнавали невдачі, що свідчить про відсутність поліаденілювання в цих послідовностях. Крім того, CDS5 містив мутацію зсуву рамки, яка вставляла стоп-кодон у третій екзон. Ці дані дозволили нам зробити висновок, що CDS5 і CDS6, ймовірно, є псевдогенами, які виникли в результаті тандемної дуплікації геномної ділянки CDS7, і тому ми позначили їх як CDS5P і CDS6P.

Початкова оцінка генів-кандидатів alr2 проводилась за двома критеріями. Той факт, що реакції алорозпізнавання вимагають контакту між клітинами і включають тканинну адгезію [

• Buss L.W.
• McFadden C.S.
• Keene D.R.

Біологія гідрактінієвих гідроїдів. 2. Конкурентний механізм ефекторної системи гістосумісності, опосередкований виділеннями нематоцист.

Biol. Бюл. 1984; 167 : 139-158

• Lange R.
• Plickert G.
• Müller W.A.

Гістонесумісність у низьких безхребетних, Hydractinia echinata: аналіз механізму відторгнення.

J. Exp. Zool. 1989; 249 : 284-292

] припускає, що alr2 є мембраноасоційованим білком. Крім того, кандидат на alr2 повинен демонструвати значний поліморфізм між гістологічно несумісними інбредними штамами, тобто між алелями f та r. Лише CDS7 виявився таким, що кодує трансмембранний білок та має високополіморфний позаклітинний домен (Таблиця S1). Було передбачено, що CDS7 містить 9 екзонів з повною довжиною кДНК 2,3 кб, що кодує 672 амінокислоти (Рис. 2D). Білок був передбаченим трансмембранним білком типу I з сигнальним пептидом 18 амінокислот (аа), за яким слідувала позаклітинна ділянка 411 аа, що складалася з трьох доменів, однієї трансмембранної спіралі 23 аа та цитоплазматичного домену 220 аа. Цитоплазматичний домен містив мотив ендоцитозу та потенційні сайти фосфорилювання для тирозинкінази, протеїнкінази С та казеїнкінази ІІ. Ми також провели пошук CDS7 на наявність мотивів активації імунорецепторів на основі тирозину (ITAMs) (Y-xx-I/L-x_(6-12)-Y-xx-L/I, де x – будь-яка амінокислота) та імунорецепторні тирозинові інгібіторні мотиви (ITIMs) ((I/L/V/S)-x-Y-xx-I/V/L), сигнальні мотиви, які часто зустрічаються в цитоплазматичних доменах імунних рецепторів хребетних [

• Barrow A.D.
• Trowsdale J.

Ви кажете ITAM, а я кажу ITIM, давайте скасуємо все це: неоднозначність сигналізації імунорецепторів.

Eur. J. Immunol. 2006; 36 : 1646-1653

]. Хоча ми не виявили жодного канонічного ITAM або ITIM, ми знайшли один ITIM-подібний мотив (N-x-Y-xx-V), раніше ідентифікований на членах сімейства лейкоцитарних імуноглобуліноподібних рецепторів (LIR) [

• Cosman D.
• Fanger N.
• Borges L.

Цитомегаловірус людини, MHC класу I та інгібіторні сигнальні рецептори: більше питань, ніж відповідей.
Immunol. Rev. 1999; 168 : 177-185

] (Рис. 2Д). Вирівнювання CDS7- f і CDS7- r виявило 26 аа поліморфізмів, з яких 17 були розташовані в області 114 аа, що кодується екзоном 2 (Рис. 2Д). Цей рівень поліморфізму був найвищим серед будь-якої експресованої послідовності в геномній області alr2 (Таблиця S1). Гібридизація методом Саузерн-блот підтвердила, що CDS7 є однокопійною послідовністю в геномі Hydractinia (Рис. S2).

BLASTP-пошук за CDS7 повернув значні збіги з різними білками з суперсімейства імуноглобулінів. Ці вирівнювання були виключно між позаклітинною частиною CDS7, що кодується екзонами 2, 3 і 4 (далі – домени I, II і III; Рисунок 2D) і повними або частковими імуноглобуліноподібними (Ig-подібними) доменами. Хоча найбільш значне вирівнювання було з гіпотетичним білком Brugia (2 × 1 0-6 , 23% ідентичності), більшість BLAST-співпадінь були з членами сімейства IgLON молекул адгезії нервових клітин зі схожими значеннями e- і % ідентичності (див. Додаткові результати та обговорення). Для подальшого вивчення подібності між CDS7 і суперсімейством Ig ми провели пошук в базах даних консервативних доменів і виконали пошук подібності на основі третинної структури, яка повинна бути чутливою до віддалених гомологій. Ці методи послідовно передбачали Ig-подібні складки для доменів I-III, причому домен I найбільш подібний до доменів V-набору, а домени II-III найбільш подібні до доменів I-набору (Таблиця S2). Множинні вирівнювання послідовностей між доменами I-III та канонічними доменами I- та V-набору показали, що домени Hydractinia відповідають загальним залишкам каркасу V/I-набору [

• Harpaz Y.
• Chothia C.

Багато доменів суперсімейства імуноглобулінів у молекулах клітинної адгезії та поверхневих рецепторах належать до нового структурного набору, близького до того, що містить варіабельні домени.

J. Mol. Biol. 1994; 238 : 528-539

] у багатьох позиціях, хоча лише домен II містив висококонсервативний триптофан, а всі інші домени були позбавлені гіперконсервативних цистеїнів, характерних для більшості Ig-подібних доменів (Рисунок S3 та Додаткові результати та обговорення). Разом ці аналізи показують, що домени I-III є найбільш подібними до Ig-подібних доменів і припускають, що CDS7 може бути новим членом суперсімейства Ig, хоча і окремим.

BLAST-пошук за єдиним секвенованим геномом гідрозої, Hydra magnipapillata, повернув єдине значуще вирівнювання між доменами I-III CDS7 та трьома Ig-подібними доменами від передбачуваної титиноподібної молекули (e = 0,009, 24% ідентичності, ідентифікатор скаффолду: NW_002165237). Аналогічно, BLAST-пошук в геномі анемони зірчастої, Nematostella vectensis, повернув значні вирівнювання між доменами II і III і декількома передбачуваними членами Ig-надродини, з найкращим збігом з передбачуваним білком, подібним до молекул адгезії нервових клітин ссавців (e = 1 × 1 0-5 , 27% ідентичності, приєднання: XP_001637446). Ми не виявили синтезу між геномною областю alr2 та геномом Nematostella, але виявили два невеликих треки синтезу між інтервалом alr2 та двома різними скафолдами в збірці геному Hydra (рис. S4). Жоден з треків синтезу не включав CDS7, і жоден зі скафолдів Hydra не кодував жодних генів з імуноглобуліноподібними доменами. Пошуки TBLASTN з CDS7 проти cnidarian EST не дали значних вирівнювань. Не було виявлено значної подібності між CDS7 та білками FuHC і алорозпізнавання гнійників з протохордного тунікату Botryllus schlosseri [

• De Tomaso A.W.
• Nyholm S.V.
• Palmeri K.J.
• Ishizuka K.J.
• Ludington W.B.
• Mitchel K.
• Weissman I.L.

Виділення та характеристика локусу гістосумісності протохордових.
Природа. 2005; 438 : 454-459

• Nyholm S.V.
• Passegue E.
• Ludington W.B.
• Voskoboynik A.
• Mitchel K.
• Weissman I.L.
• De Tomaso A.W.

Фестер, кандидат алорозпізнавального рецептора від примітивних хордових.
Імунітет. 2006; 25 : 163-173

Експресія гена-кандидата alr2

Ген-кандидат alr2 повинен експресуватися у всіх тканинах, здатних до алорозпізнавання. У Hydractinia пізні личинки, поліпи та тканини матки демонструють явища алорозпізнавання [

• Buss L.W.
• McFadden C.S.
• Keene D.R.

Біологія гідрактінієвих гідроїдів. 2. Конкурентний механізм ефекторної системи гістосумісності, опосередкований виділеннями нематоцист.

Biol. Бюл. 1984; 167 : 139-158

• Lange R.
• Plickert G.
• Müller W.A.

Гістонесумісність у низьких безхребетних, Hydractinia echinata: аналіз механізму відторгнення.

J. Exp. Zool. 1989; 249 : 284-292
], тоді як бластули та личинки на ранніх стадіях не відторгаються [

• Poudyal M.
• Rosa S.
• Powell A.E.
• Moreno M.
• Dellaporta S.L.
• Buss L.W.
• Lakkis F.G.

Ембріональний химеризм не індукує толерантність у модельному організмі безхребетних.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2007; 104 : 4559-4564

• Lange R.G.
• Dick M.H.
• Müller W.A.

Специфіка та ранній онтогенез гісторозпізнавання у гідроїдних Hydractinia .
J. Exp. Zool. 1992; 262 : 307-316

]. Експресія CDS7 була оцінена якісно за допомогою RT-PCR в пулах кДНК, що представляють п’ять типів тканин (яйця, 64-клітинні ембріони, 2-3-денні личинки, матка та поліпи) і була виявлена у всіх досліджених тканинах (Рис. 3А). Кількісна RT-PCR показала, що експресія була найвищою в тканині дорослої матки (Рис. 3B). Ми підозрюємо, що експресія CDS7, яку ми спостерігали в ранніх ембріональних тканинах, відображає необхідність розгортання алодетермінант в ранньому онтогенезі колонії, оскільки колонії Hydractinia мають короткоживучі, неживильні личинки, які оселяються на панцирах крабів-відлюдників у специфічному для місця способі і мають високу ймовірність зіткнення з конспецифіками відразу після метаморфозу [

• Yund P.O.
• Cunningham C.W.
• Buss L.W.

Рекрутингові та пострекрутингові взаємодії в колоніальному гідроїді.
Екологія. 1987; 68 : 971-982

Поліморфізм та прогнозування фенотипу гена-кандидата alr2

Для подальшої характеристики ролі CDS7 як алодетермінанта ми використали суворий тест, подібний до того, що був використаний для ідентифікації локусу гістосумісності FuHC у Botryllus [

• De Tomaso A.W.
• Nyholm S.V.
• Palmeri K.J.
• Ishizuka K.J.
• Ludington W.B.
• Mitchel K.
• Weissman I.L.

Виділення та характеристика локусу гістосумісності протохордових.
Природа. 2005; 438 : 454-459

]. Оскільки колонії Hydractinia повинні мати принаймні один алель або alr1, або alr2, або обидва, щоб уникнути відторгнення, а злиття і транзиторне злиття надзвичайно рідкісні між колоніями, зібраними в польових умовах [

• Гросберг Р.К.
• Levitan D.R.
• Cameron B.B.

Еволюційна генетика алорозпізнавання у колоніальних гідроїдних Hydractinia symbiolongicarpus.
Evolution Int. J. Org. Evolution. 1996; 50 : 2221-2240

• Mokady O.
• Buss L.W.

Генетика передачі алорозпізнавання у Hydractinia symbiolongicarpus (Cnidaria:Hydrozoa).
Генетика. 1996; 143 : 823-827

• Nicotra M.L.
• Buss L.W.

Тест на личинкові родинні агрегації.
Biol. Бюл. 2005; 208 : 157-158
], передбачається, що ці локуси є високополіморфними [

• Гросберг Р.К.

The evolution of allorecognition specificity in clonal invertebrates.
Q. Rev. Biol. 1988; 63 : 377-412

]. Більше того, пари зібраних у полі колоній, які не відторгаються, повинні мати принаймні один спільний алель на рівні alr1 або alr2, що є подією, яка навряд чи може відбутися випадково [

• Гросберг Р.К.

The evolution of allorecognition specificity in clonal invertebrates.
Q. Rev. Biol. 1988; 63 : 377-412

Ми оцінили поліморфізм CDS7, дослідивши алелі з наших двох інбредних штамів та семи колоній дикого типу, загалом 16 алелів. Домен I був дуже варіабельним (Рис. 4А) і мав в середньому 31 парну відмінність між алелями. Хоча 68/111 амінокислотних позицій в домені I відрізнялися щонайменше між двома алелями, більшість залишків, які вирівнювалися з консервативними залишками V/I-рамки в канонічних Ig-подібних доменах, були інваріантними (Рис. 4B). Ми також проаналізували CDS7 на наявність ознак позитивного відбору, визначивши кодони, в яких оціночна частота несинонімічних мутацій перевищувала частоту синонімічних мутацій. Очікується, що системи алорозпізнавання перебувають під впливом позитивного частотно-залежного відбору, який надає перевагу рідкісним алелям [

• Гросберг Р.К.

The evolution of allorecognition specificity in clonal invertebrates.
Q. Rev. Biol. 1988; 63 : 377-412
]. Аналіз сайтів за допомогою статистичного пакету HyPhy Statistical [

• Pond S.L.K.
• Frost S.D.W.

Datamonkey: швидке виявлення селективного тиску на окремі сайти вирівнювання кодонів.
Біоінформатика. 2005; 21 : 2531-2533

] ідентифікували шість позитивно селективних кодонів, всі в межах домену I (рис. 4B і табл. S3). Таким чином, CDS7 мав обидві ознаки частотно-залежної селекції – високу кількість алелів при низькій частоті [

• Wright S.

Розподіл алелів самостерильності в популяціях.
Генетика. 1939; 24 : 538-552
] і позитивно дібраних сайтах.

Щоб перевірити, чи може CDS7 передбачати реакції алорозпізнавання, ми перевірили колонії, зібрані в полі, на їх здатність зливатися з інбредними колоніями, що несуть алелі f (n = 497) або r (n = 508) в alr1 та alr2 . Лише дві колонії (0,2%) не змогли відторгнути лабораторні штами. Колонія LH416 демонструвала транзиторне злиття типу II проти колонії f-тестера, що відповідає f-подібному алелю в alr1, а колонія LH82 демонструвала транзиторне злиття типу I проти колонії f-тестера, що відповідає f-подібному алелю в alr2. Ми секвенували повнорозмірні кДНК для двох алелів CDS7 з LH82 (позначені a і b), а також геномні ділянки, що їх кодують. Передбачувані амінокислотні послідовності алелів a і f відрізнялися в 41/672 сайтах, включаючи 31/119 сайтів в домені I. На відміну від цього, алелі b і f були на 100% ідентичні в домені I і відрізнялися лише в 7/672 сайтах (1 в сигнальному пептиді, 1 в домені III, 1 в решті позаклітинного домену і 4 в цитоплазматичному домені). Тестове схрещування між LH82 (CDS7- a/b) та колонією, гомозиготною за r в обох локусах алорозпізнавання, продемонструвало, що алель CDS7- b косегрегує зі здатністю демонструвати транзиторне злиття з колоніями, що несуть алель CDS7- f (кількість нащадків у схрещуванні = 12; 5 нащадків CDS7- a/r, всі відкинули гомозиготний f-тестер; 7 нащадків CDS7- b/r, всі продемонстрували транзиторне злиття з гомозиготним f-тестером). Таким чином, єдина колонія дикого типу з фенотипом, що вказує на те, що вона має спільний алель alr2 з нашою f інбредною лінією, також несла алель CDS7, на 100% ідентичний алелю f по гіперваріабельному позаклітинному домену. Наразі проводиться більш детальний аналіз карти між варіаціями послідовностей та злиттям у природних популяціях.

Оскільки наші дані вказували на те, що CDS7 є алодетермінантом у наших інбредних лініях, демонструє широкий природний поліморфізм і прогнозує реакції алорозпізнавання між нашими інбредними лініями та колоніями, зібраними в польових умовах, ми дійшли висновку, що він є alr2 . Ідентифікація цього гена гістосумісності кишковопорожнинних створює безпосередню можливість вирішити кілька давніх питань про алорозпізнавання безхребетних, включаючи популяційно-генетичні механізми, що підтримують варіації, роль, яку відіграє химерія в розподілі та чисельності колоніальних організмів, а також ступінь збереження, якщо така є, між системами алорозпізнавання в колоніальних таксонах. Крім того, часто припускають взаємозв’язок між системами алорозпізнавання кишковопорожнинних і протохордових або між системами алорозпізнавання безхребетних і елементами імунної системи хребетних, зокрема, MHC. Хоча Ig-подібні домени виявлені в імунних молекулах хребетних, в гені Botryllus FuHC і, можливо, в alr2, схоже, немає ніякої додаткової подібності між відомими поверхневими молекулами в цих трьох системах. Дійсно, все більше доказів свідчить про те, що тварини розвинули різноманітні унікальні молекулярні механізми для розрізнення себе від не-себе, включаючи MHC у хребетних, VCBPs у протохордових [

• Cannon J.P.
• Haire R.N.
• Litman G.W.

Ідентифікація диверсифікованих генів, що містять імуноглобуліноподібні варіабельні ділянки у протохордових.

Source: cell.com