Без кейворду

Всі рифові акваріумісти добре знають, наскільки схильні до катастроф їх акваріуми. Одна з найпоширеніших мудростей в цьому хобі говорить: “Катастрофи трапляються швидко, успіх вимагає часу і терпіння”. Звідси зрозуміло, що коли щось йде не так, проблеми, що виникають, часто виникають швидко. Усвідомлюючи хиткий характер наших штучних екосистем, більшість любителів роблять все, що в їх силах, щоб гарантувати, що їх прекрасні і дорогі створіння не загинуть. Багато любителів мають запобіжники на випадок відключення електроенергії, несправностей обладнання, проблем з рівнем води та хімічного дисбалансу. Парадоксально і прикро, що всі ці заходи безпеки можуть бути значною мірою зведені нанівець через використання штучної морської води, яка через погану рецептуру може отруювати тих самих тварин, яких любитель намагається захистити.

Серед професійних морських біологів, особливо тих, хто працює з ембріонами безхребетних, середньостатистична суміш штучної морської води вже багато років визнається недосконалим замінником того, що є ідеальним середовищем для росту морських тварин – чистої океанічної морської води. Особливо це стосується таких делікатних організмів, як ембріони (Strathmann, 1987). Морські організми розвивалися в природній морській воді, і природний відбір пристосував їх фізіологію до цього середовища. Багато з цих організмів не мають водонепроникної шкіри, і благополуччя істоти безпосередньо залежить від розчину, що їх оточує. Хоча існує певна толерантність до варіацій від “нормального” стану до того, до якого пристосовані тварини, загалом ця толерантність невелика і обмежена лише діапазоном природних варіацій (Prosser, 1991).

Морська вода – це не просто розчин хлориду натрію і води, а скоріше складна і до кінця не вивчена суміш практично всіх речовин, які коли-небудь прикрашали обличчя Землі. Все, що може бути змито вниз за течією, в кінцевому підсумку потрапляє в моря і включається в розчин океанів (Pilson, 1998). Величезний об’єм Світового океану гарантує, що концентрація більшості цих матеріалів у розчиненому стані є досить низькою, в діапазоні частин на мільярд або навіть менше. Одна частина на мільярд – це невелика кількість, і для візуалізації такої крихітної частки іноді необхідна допомога. Одна унція на мільярд унцій може бути візуалізована в наступному прикладі. Якщо припустити, що середньостатистична людина важить близько 150 фунтів, то одна частина на мільярд буде еквівалентна одному унції першого класу в кишені одного з 416 667 людей І все ж, організми реагують на матеріали, присутні в навіть набагато менших концентраціях, ніж частини на мільярд.

На базовому клітинному рівні все життя залежить від належного функціонування складної серії взаємопов’язаних і сполучених хімічних реакцій. Ці реакції регулюються і контролюються ферментами, можливості яких визначаються властивостями внутрішнього клітинного середовища. У багатьох морських істот внутрішнє клітинне середовище безпосередньо залежить від морського водного середовища, яке оточує організм. Зміна солоності, наприклад, часто є безпосередньою причиною змін у клітинному метаболізмі. Крім того, хімічні речовини, розчинені в середовищі морської води, можуть безпосередньо впливати на функціональність клітин. Особливо це стосується іонів металів у морській воді.

Іони металів утворюються в результаті розчинення солей деяких металів у воді і часто є дуже важливими у функціонуванні ферментів. У належних кількостях різні іони металів гарантують, що ферменти мають правильну форму і виконують відповідну функцію. Однак у неправильних концентраціях багато іонів металів можуть втручатися в структуру ферментів і змінювати її. Ці зміни, як правило, спричиняють серйозні проблеми для організму. Наприклад, дуже невеликі кількості міді, саме ті кількості, які зазвичай містяться в природній морській воді, абсолютно необхідні для правильного функціонування дихального пігменту, гемоціаніну, у членистоногих і молюсків. Однак, незначне збільшення кількості міді у воді, що оточує організми, призведе до аналогічного збільшення у внутрішньому клітинному середовищі, що спричинить денатурацію інших клітинних ферментів, вбиваючи ці ж самі організми.

Мідь – не єдиний метал, який утворює іони, що втручаються в клітинний метаболізм, насправді це втручання є загальною властивістю більшості металів, особливо тих, які називають “важкими металами”. Це такі елементи, як мідь, ртуть, залізо, свинець, срібло, цинк, ванадій, нікель і будь-яка кількість інших. Саме смертельна небезпека цих матеріалів для всього живого, в тому числі і для людини, стала причиною появи багатьох екологічних норм, що стосуються скидів у водні шляхи і океани. До появи багатьох органічних пестицидів багато з використовуваних пестицидів були просто сумішами різних солей міді, цинку, миш’яку, ртуті та інших “мікроелементів”. Присутні в дуже низьких концентраціях, як правило, тих, що містяться в природній морській воді, більшість з цих матеріалів не є шкідливими; проте, в дещо підвищених концентраціях вони вбивають організми. (Див., наприклад, Alutoin, et al., 2001; Breitburg, et al. 1999; Goh, and Chou, 1992; Heyward, 1988; Negri, and Heyward, 2001; Reichelt-Brushett and Harrison, 1999).

За останні пару років я задокументував аномально високий рівень важких металів, виявлений в акваріумних системах, і припустив, що ці метали є причиною деякої смертності або “крихкості” організмів, які спостерігаються у акваріумістів-любителів (Shimek, 2002a-e). Багато важких металів постійно додаються в акваріуми з кормами, які є необхідним доповненням до рифових акваріумів (Shimek, 2001). Організми зазвичай детоксикують важкі метали, навіть при нормальних рівнях, шляхом їх незворотного зв’язування з білками у своєму організмі. Це призводить до накопичення токсичного матеріалу в організмі тварини протягом усього її життя. Якщо такі організми використовуються в рецептурі акваріумного корму або згодовуються безпосередньо акваріумним організмам, то отримані в результаті корми можуть передавати досить високі і значні кількості важких металів в наш організм.

Старий вислів інженерного корпусу армії “Рішенням проблеми забруднення є розведення” залишається в силі, і на природних рифах часткове розчинення їжі, перетравлення та виведення призведе до розповсюдження і, як наслідок, зменшення потенційно токсичного навантаження мікроелементів. Однак в акваріумах, на відміну від справжнього рифу, металам нікуди діватися. Фільтрація та експорт можуть видалити деякі з цих матеріалів, але це не особливо ефективний процес (Shimek, 2002e), особливо враховуючи, що деякі з цих важких металів можуть бути знайдені в надмірно високих концентраціях.

Багато з цих надмірно високих концентрацій, однак, не є результатом годівлі або навіть безглуздого і небезпечного процесу додавання токсичних металів безпосередньо в резервуари у вигляді добавок, а є прямим результатом рецептури сольових сумішей (Аткінсон і Бінгман, 1999 р.). Хоча потенційна токсичність таких сумішей була прокоментована, до цього часу не проводилося прямих кількісних випробувань вод, виготовлених з використанням штучних сольових сумішей, щоб визначити, чи є вони самі по собі токсичними для організмів. У цій статті повідомляється про перший з таких тестів.

Матеріали та методологія

Одним із стандартних методів тестування токсичності води є використання біологічних тестів. Біотести – це просто тести на токсичність, що проводяться з використанням живих організмів, поміщених у воду, і реєстрацією їх реакцій. Вони є стандартною частиною тестування на токсичність як прісних, так і морських вод, і застосовуються вже кілька десятиліть. Метод, який я вирішив використати, є варіантом одного з багатьох біоаналізів личинок морських їжаків, які широко застосовуються в екологічних дослідженнях. Буквально сотні варіантів цього тесту використовуються в усьому світі, з процедурами тестування, пристосованими до проекту і піддослідних тварин, що є під рукою. Я максимально спростив тест, щоб уникнути трудомістких процедур. При цьому я пожертвував деякою інформацією, яку можна було б отримати з такого тесту. Замість цього я сконцентрувався на простому підході “так/ні”, ставлячи питання:

“Чи впливає тип використовуваної штучної солоної води на кількість личинок, які можуть розвинутися після певної кількості ембріональної експозиції в конкретному середовищі”.

Коротко кажучи, для цього тесту я помістив приблизно рівну кількість ембріонів на ранній стадії розвитку (= запліднених яєць) в склянки з різними типами морської води, і через два дні я підрахував всіх личинок, які розвинулися в кожній склянці. Кількість личинок, знайдених у кожному з розчинів, потім порівнювали, щоб оцінити будь-які відмінності між розчинами. Крім того, кількість личинок з тестових розчинів порівнювали з кількістю, виявленою в природній морській воді (негативний контроль) і в розчинах дихлориду купруму, відомого токсиканта (позитивний контроль).

Мною були протестовані наступні солі: Instant Ocean (Aquarium Systems, Inc.), Bio-Sea Marinemix (Aqua Craft, Inc.), Crystal Seas Marinemix – Bioassay Formula (Marine Enterprises International, Inc.) та Coralife (Energy Savers Unlimited, Inc.). Розчинний океан та Коралайф були придбані у докторів Фостера та Сміта. Невідкриту упаковку морської суміші Bio-Sea Marine Mix надав рифовий акваріуміст. Морська суміш Crystal Seas Marine Mix – Формула біоаналізу була доставлена безпосередньо від виробника. Я також протестував акваріумну воду від двох любителів, кожен з яких надіслав мені по галону води зі свого акваріума для тестування. Ця вода була зібрана і відправлена в пластикові контейнери для дистильованої води об’ємом один галон, які були придбані; дистильована вода була викинута, а контейнери заповнені водою з бака. Оскільки ця акваріумна вода прибула за деякий час до випробування, вона зберігалася в замороженому стані до самого випробування, коли її розморозили і довели до кімнатної температури. Обидва любителі змішували воду в своїх акваріумах, використовуючи Instant Ocean. Один любитель використовував воду RO/DI, інший – воду зі свердловини. Природна морська вода була отримана від компанії Catalina Water Company (1605 Pier D Street, Long Beach, California. 90802).

За день до прибуття піддослідних тварин я змішав по одному галону кожної з соляних сумішей для тестування. Всі посудини, що використовувалися в тесті, були вимиті кислотою і добре промиті в дистильованій воді, після чого їм дали висохнути на повітрі. Солі були змішані до питомої ваги 1,024 за температури 75°F, щоб відповідати природній морській воді. Ці вимірювання були зроблені за допомогою гідрометра з еталонною температурою 60 градусів за Фаренгейтом; і скориговані для компенсації різниці між відкаліброваною температурою і температурою навколишнього середовища. Інформація про калібрування і використання гідрометра доступна в Інтернеті на кількох сайтах.

Для кожного розчину, що випробовувався, я створив 11 повторень. Десять реплік використовувалися в тесті і не порушувалися під час тесту після його початку; інші використовувалися для спостереження за розвитком під час тесту, якщо я вважав, що це необхідно. Кожна реплікація складалася з 150 мл досліджуваного розчину в новій, невикористаній пластиковій склянці Tri-Stir на 250 мл. Під час тестування склянки були накриті пластиковою чашкою Петрі, щоб запобігти забрудненню або випаровуванню. Перемішування або аерація не забезпечувалися. Всі склянки були промарковані для позначення розчину в них, і склянки були розташовані випадковим чином на столі в моєму офісі/лабораторії. Випробування проводили при кімнатній температурі. Протягом дослідження вона варіювалася від 72°F до 82°F. Це трохи тепліше, ніж було б оптимально, але в межах прийнятності для даного виду.

Піддослідними тваринами були Arbacia punctulata, морські їжаки, що мешкають уздовж східного узбережжя Сполучених Штатів. Я придбав 12 їжаків у Gulf Specimen Aquarium and Marine Supply, Post Office Box 237, Panacea, FL 32346. Вони були доставлені мені повітряним транспортом і були використані після прибуття. Я розпакував їх і помістив у невеликий акваріум, наповнений природною морською водою кімнатної температури. Нерест був індукований стандартним способом, ін’єкцією двох мілілітрів 0,53 М розчину хлориду калію через перистоміальну мембрану в перивісцеральний целом. Нерест у більшості тварин розпочався негайно.

Більше інформації про Arbacia punctulata та її ембріологію можна знайти за цим посиланням:

Рисунок 1. Нерест самця Arbacia punctulata. Тварина перевернута над склянкою. Статеві пори знаходяться на аборальній поверхні, тут вони звернені донизу. Періодично я змивав у воду сперму, що збиралася на їжаку. Помаранчеві ікринки від самки, що раніше відклала ікру, видно в склянці зліва. На задньому плані видно експериментальні склянки, накриті чашками Петрі.

Ікру збирали шляхом перевертання нерестовиків над склянками з природною морською водою. Сперму збирали, змиваючи піпеткою сперму з аборальної поверхні у склянки, наповнені природною морською водою. З 12 введених A. punctulata 8 були самцями, 2 – самками і 2 не нерестилися. Після завершення нересту ікру промивали, перемішуючи її, даючи їй осісти і обережно зливаючи воду, що стояла над нею. Потім додавали свіжу природну морську воду, і процес промивання повторювали тричі. Суспензії сперматозоїдів були змішані разом, енергійно перемішані, і розведення сперми 1:200 було змішано в новій склянці…

Яйцеклітини були мікроскопічно досліджені, щоб переконатися, що вони були зрілими за відсутністю зародкового пухирця та однорідною формою. Сперматозоїди мікроскопічно досліджували, щоб переконатися в рухливості сперматозоїдів. Один мілілітр суспензії сперматозоїдів додавали в склянку для яйцеклітин і ретельно перемішували розчин за допомогою піпетки. Зразки були вилучені і досліджені мікроскопічно, щоб переконатися, що зразок був запліднений. Після того, як запліднення було відзначено, приблизно один мілілітр суспензії запліднених яєць піпеткою вносили в кожну з реплік (в результаті чого кожна репліка мала від 50 до 80 запліднених яєць).

Рисунок 2. Яйцеклітина Arbacia punctulata до запліднення.

Цей вид швидко розвивається при температурах, що використовувалися в цьому дослідженні, і через 48 годин личинки досягли стадії раннього плутеуса. Це перша стадія харчування, і оскільки я не хотів ускладнювати тест годуванням тварин, тест був припинений на цій стадії. Вміст склянки досліджували під 40-кратним збільшенням, підраховували та реєстрували всі плутеї або інші личинкові форми. Це було зроблено для всіх десяти повторень. Як правило, на цьому етапі розчини та личинки відкидалися.

Рисунок 3. Розвиток відбувається швидко, двоклітинна стадія (ліворуч) та чотириклітинна стадія (в центрі) були досягнуті протягом години після запліднення. Стадія призми (праворуч) була присутня через добу після запліднення. Призма рухлива і плаває в культурі, але кишечник ще не розвинувся і вона не може харчуватися.

Рисунок 4. Личинка Arbacia punctulata раннього плейстоцену. Зліва: личинка на стадії, коли тест було припинено. Видно внутрішні скелетні стрижні та червоні пігментовані клітини. Личинка має пірамідальну форму з вершиною праворуч. Хоча вона має кишечник, його не видно на цьому зображенні. Ці личинки пересуваються за допомогою двох довгих “рук”, які ведуть вперед, коли вони харчуються водоростями. Праворуч: Трохи старша личинка, яка харчується одноклітинною водоростю хлорелою. Видно кишечник, заповнений зеленими клітинами водоростей.

Результати тесту були зведені в таблицю і проведений однофакторний дисперсійний аналіз (ANOVA). Відмінності, отримані в результаті ANOVA, вимагали проведення подальших t-тестів на відмінності в середніх вибіркових значеннях, вважаючи, що вибірки мають нерівні дисперсії. Ці t-тести були проведені шляхом порівняння кількості ембріонів у кожній експериментальній групі (чотири сольові суміші та два аматорські акваріуми) з кількістю ембріонів, знайдених у природній морській воді. Всі статистичні розрахунки були виконані за допомогою аналітичної частини пакета електронних таблиць Corel Quattro Pro 8.

Кількість личинок, знайдених через 48 годин, варіювала в широких межах (табл. 1). Зразки штучної морської води, виготовлені з використанням препарату Instant Ocean, містили в середньому 4,0 личинки на репліку, тоді як зразки з використанням препарату Coralife – 7,4 личинки на контейнер. Зразки з Hobbyist B також містили низьку кількість личинок, 5,1 на контейнер. Середня кількість личинок у зразках природної морської води, Crystal Sea Marinemix-Bioassay Formula та BioSea Marinemix мала більшу середню кількість личинок, що становила від 35,8 до 41,5 личинок на реплікацію. У природній морській воді, дозованій дихлоридом міді, де концентрація міді дорівнювала або перевищувала 100 ppb, личинок не було виявлено.

Source: reefkeeping.com