Без кейворда

Примечание: Пожалуйста, распространите это в как можно большем количестве источников, форумов, клубов, журналов, магазинов или других мест. Пожалуйста, направьте заинтересованных лиц на эту статью или свяжитесь со мной по электронной почте eborneman@uh.edu.

История вопроса и введение

В течение многих лет кораллы элеганс (Catalaphyllia jardinei) были одними из самых простых кораллов для содержания в аквариумах. В последние пять лет большинство из них, поступающих в продажу, обречены из-за заболевания, для которого не существует ни известной причины, ни лекарства. В этом состоянии коралл принимает относительно раздутый ротовой диск с бахромой нерасправленных щупалец. Ткани коралла в конечном итоге сжимаются, и коралл погибает, несмотря на всевозможные экспериментальные вмешательства.

Большинство Catalaphyllia на этой фотографии имеют нормальный здоровый вид, за исключением одного, демонстрирующего характерные сморщенные щупальца и (обычно) ненормальную окраску.

В некоторых случаях может присутствовать белая непрозрачная слизеподобная паутина. Я не уверен, является ли это совершенно отдельным состоянием, каким-то образом связанным, вторичным по отношению к первичному состоянию, или частью одного и того же состояния.

Было много предположений о том, почему сейчас возникает это состояние, и различные источники предлагают причины и даже способы лечения. Но я подчеркиваю, что, насколько мне известно, никаких исследований по этому состоянию не проводилось, и на сегодняшний день ни одна из потенциальных причин, решений или способов лечения не кажется обоснованной.

Эти кораллы чрезвычайно красивы и желанны. К сожалению, сегодня их низкая выживаемость в неволе ставит их в один класс с Goniopora stokesi, где выживаемость слишком низка, чтобы оправдать крупномасштабный сбор этих кораллов в дикой природе. На самом деле, Catalaphyllia являются относительно редкими видами и, возможно, подвергаются чрезмерному сбору, так что популяции в некоторых районах сбора находятся под угрозой исчезновения или даже вымирания. Продолжение сбора редких видов, выживаемость которых крайне низка, вредно для всех – это экономические потери, растрата ресурсов и источник большого разочарования для всех, кто приобретает и пытается сохранить их жизнь.

Не все каталафиллии имеют признаки этого заболевания. Иногда я вижу их в магазинах с нормальным здоровым видом. Во время обследования мест сбора кораллов я ни разу не видел ни одного экземпляра с таким состоянием в дикой природе, а из сотен особей, содержащихся в аквариумах для экспорта, только один экземпляр имел признаки патологии. Конечно, Catalphyllia собирают в совершенно разных местах обитания, и, возможно, в совсем других местах, чем те, где их собирали много лет назад, когда их было легко содержать. Я могу логически рассуждать о многих возможных причинах их нынешнего состояния и гибели, но, к сожалению, эти рассуждения будут не лучше, чем полное отсутствие понимания этого состояния, которое существует в настоящее время.

В связи с желательностью и огромной популярностью Catalaphyllia, а также с целью узнать больше об этом крайне неизученном виде и помочь обеспечить популяции диких кораллов элегантности и их успех в неволе, я предлагаю провести официальное исследование этого состояния, чтобы попытаться определить его причину и возможные решения, чтобы мы снова могли наслаждаться здоровыми кораллами элегантности в наших аквариумах.

Область моих исследований – изучение болезней кораллов с неизвестной в настоящее время этиологией. Я хотел бы предложить свои услуги, чтобы помочь найти ответы на вопросы о состоянии кораллов элегантности. Вместе с коллегами я считаю, что мы сможем определить причину высокой смертности, вызванной этим заболеванием. Я постараюсь сделать это наиболее экономичным и эффективным способом, и по завершении работы предоставлю результаты на все соответствующие форумы.

Я предлагаю собрать финансирование и материалы для проведения этой работы, и сделать это поэтапно, чтобы не потребовалось больше финансирования или материалов, чем необходимо.

Catalaphyllia необходимо приобретать из различных источников, как здоровых, так и пораженных этим заболеванием. В некоторых случаях могут потребоваться специальные меры по доставке, чтобы избежать задержек или облучения, которые могут спутать любые ранее существовавшие условия из дикой природы. Кораллы отправляются либо живыми, либо мертвыми и консервируются для анализа. Как правило, используется формалин или спиртовой фиксатор, и не у всех есть доступ к некоторым фиксаторам. Затем я буду исследовать кораллы, работая от наиболее очевидных к менее очевидным. Внешние и грубые изменения будут документироваться на живых образцах с четким описанием признаков, изменений, временных рамок и судьбы коралла, с которым связано данное состояние. Я буду изучать колонизацию поверхностной флоры и фауны с помощью стерильных тампонов, брать образцы живого материала и замораживать их для любой будущей молекулярной работы, которая может потребоваться. Я подготовлю гистослайды для изучения микроструктуры и поиска очевидных аномалий в тканях или зооксантеллах, а также наличия или отсутствия внутриклеточных паразитов или патогенов. На этом этапе что-то может проявиться или не проявиться. Я подготовлю отчет, предложу свои лучшие предложения по следующему этапу, если причина все еще неизвестна, и изложу следующий запрос на финансирование и материалы.

Первоначальные требования

На начальном этапе, по крайней мере, единственное, что мне понадобится, это кораллы – как можно более разнообразные во времени и пространстве. Например, заказ 100 кораллов у одного и того же оптовика в один и тот же день будет гораздо менее ценным, чем несколько кораллов из разных источников в разные периоды времени для увеличения разнообразия образцов. Мне нужны элегантные кораллы из как можно большего числа источников. Ниже перечислены источники, из которых в идеале должны поступать образцы.

Прямо из дикой природы Экспортные предприятия Оптовые предприятия Розничные предприятия Домашние аквариумы

Здоровые кораллы – самая сложная часть

Живые кораллы Я хотел бы получить 5 – 10 здоровых кораллов элегантности, по крайней мере два из которых будут доставлены непосредственно из источника в мою лабораторию или в учреждение, которое готово обеспечить, чтобы образцы были помещены непосредственно в чистый закрытый аквариум со свежеприготовленной морской водой с использованием бутилированной дистиллированной воды и чистых рук в перчатках. См. протоколы ниже. Я буду пытаться связаться с источниками этого материала, но если у кого-то есть такие контакты и возможности, их усилия будут высоко оценены.

Что касается остальных здоровых образцов, то для того, чтобы определить, действительно ли данный образец не подвержен заболеванию, нужен человек с достаточным опытом. Для этого необходимо либо учреждение с регулярным оборотом каталафиллий, либо добровольцы, которые обследуют местные магазины, чтобы найти редкие здоровые экземпляры. В любом случае, я считаю, что перед приобретением или отправкой необходимо прислать фотографию для подтверждения того, что растение действительно не поражено. Если окажется, что он поражен, это не проблема, так как он все равно внесет свой вклад в исследование. Однако в качестве контроля я должен приобретать живых здоровых особей. Если здоровый (или предположительно здоровый) коралл будет найден и предоставлен, мне нужно, чтобы этот коралл был тщательно собран и отправлен, чтобы избежать любых новых источников заражения. Этот процесс будет описан ниже в разделе “Техника”.

Образцы тканей Я знаю, что видел по крайней мере несколько фотографий из аквариумов аквариумистов, у которых в аквариумах есть очевидно здоровые кораллы элеганс. У меня тоже есть один. Для тех, у кого есть здоровые кораллы элегантности и кто хочет сохранить их в своих аквариумах (скорее всего, это касается всех!), можно использовать образец ткани. Ниже в разделе “Методы” описана процедура.

Живые кораллы Catalaphyllia с признаками заболевания можно подготовить и отправить, используя тот же протокол, что и для здоровых кораллов. Их можно взять из любого источника, где они были обнаружены.

Очень важно убедиться, что до их получения не произойдет дополнительного заражения. Например, если это состояние вызвано бактерией, а аквариумисты хватают коралл руками, я беру поверхностные пробы и обнаруживаю, что на большинстве или на всех из них необычно присутствуют неморские виды стафилококков, я ошибочно рассматриваю бактерию стафилококка как возможного возбудителя. Было бы расточительно проводить исследования культур и реинфекции, чтобы выполнить постулаты Коха, когда все эти микробы были артефактами человеческой работы. То же самое касается воздействия воздуха – мы действительно хотим ограничить количество плесени, грибков, бактерий и других микробных организмов, распространенных в воздухе и на поверхностях, которые могут запутать анализы и сделать исследование более длительным, дорогим и сложным.

Фиксированные мертвые кораллы Если обнаружен пораженный Catalaphyllia и его нельзя отправить ко мне живым, я могу использовать целый коралл или образцы тканей фиксированного материала. Например, если кто-то купил или увидел Catalaphyllia, которая, по его мнению, не имеет шансов на выживание и даже может не выдержать транспортировки, ее можно убить и зафиксировать для изучения. Аналогичным образом, магазины и аквариумисты, имеющие доступ к пораженным кораллам и готовые пожертвовать образцы тканей или сами кораллы, но только если они по какой-либо причине не живы, могут сделать это путем фиксации. В разделе “Методы” ниже описана эта процедура.

Скелеты, фотографии, прямые подсчеты и поверхностные мазки

Если кто-то хочет внести свой вклад в это исследование, но не может сделать это ни одним из вышеперечисленных способов, все равно есть несколько, возможно, важных бит данных, которые можно получить. Я могу использовать скелеты мертвых Catalaphyllia, фотографии пораженных живых Catalaphyllia и фотографии скелетов недавно умерших Catalaphyllia, а также стерильные поверхностные мазки пораженных кораллов из аквариумов или из помещений. Ни одно из этих исследований, на мой взгляд, не даст убедительных доказательств, но потенциально может быть использовано для подтверждения других выводов.

Скелеты могут быть ценными из-за наличия или отсутствия различных организмов. Наличие или отсутствие скученных водорослей, грибов, моллюсков, ракообразных и других представителей флоры и фауны может присутствовать время от времени или постоянно и может заслуживать дальнейшего исследования на предмет того, играют ли они роль в состоянии организма.

Фотографирование является вспомогательным средством и может быть полезным с точки зрения документирования. Она также может предоставить доказательства грубых изменений или факторов, вовлеченных в состояние.

Еще одна полезная информация – эпизоотологическая. Было бы неплохо иметь представление о распространенности этого заболевания. Если кто-то посещает какой-либо объект, например, рыбный магазин, оптовый торговец или другой источник, простой подсчет количества присутствующих элегантных кораллов и числа пораженных колоний был бы очень полезен. Пожалуйста, укажите дату проведения подсчета, свое имя и контактную информацию, а также название объекта вместе с информацией о подсчете. Вы можете отправить мне информацию по электронной почте по адресу eborneman@uh.edu.

Стерильные мазки с поверхности кораллов могут быть полезны, если состояние связано с изменением нормальной биотической флоры, или если есть паразит или патогенный микроб, который воздействует на коралл, колонизируя его поверхность. В этом случае стерильные мазки могут быть полезны, если детальное исследование тканей покажет, что причина именно в этом.

Все протоколы для этой работы изложены ниже в разделе “Методы”.

Предоставление живых кораллов для исследования (здоровых или больных)

Вода, в которой обитает коралл, или свежеприготовленная морская вода должна быть сделана с использованием бутилированной дистиллированной воды и чистых солевых черпаков из закрытых контейнеров с солью. Коралл или любые инструменты, контактирующие с водой или кораллом, не должны использоваться, если они предварительно не обработаны асептически с помощью спирта или коммерческого асептического скраба типа Hibiclens.

Для приготовления или сбора воды используйте стеклянную емкость, тщательно протертую спиртом (предпочтительно 90%) или этанолом. Все инструменты, используемые для добавления соли и перемешивания емкости, также должны быть очищены. Руки должны быть в латексных смотровых перчатках, протертых спиртом, или руки должны быть вымыты асептическим скрабом типа Hibiclens или протерты спиртом. После мытья следует избегать прикосновения к немытой коже, волосам, одежде или другим поверхностям.

Затем в транспортный пакет или контейнер следует налить воду. Если это пакет (Ziploc или мешок для рыбы), то пакет должен быть новым и относительно герметичным, не оставленным открытым для доступа воздуха. Если контейнер (Tupperware или аналогичный), то перед добавлением воды его внутреннюю поверхность следует протереть спиртом.

Кораллы следует быстро вынуть из аквариума и поместить в подготовленную воду, которая находится в транспортном контейнере. Саму ткань следует обрабатывать как можно меньше, захватывая только скелет. Для аквариумистов, которым необходимо воспользоваться услугами местного магазина для упаковки и отправки, закрытый контейнер следует отнести в магазин и повторить ту же процедуру для переноса в другой транспортировочный пакет. В идеале кораллы следует перевозить в двойном мешке с кислородом, причем воздуха в транспортном мешке должно быть больше, чем воды. Если используется сжатый воздух, наконечник для наполнения следует протереть спиртом перед тем, как вставить его в мешок для наполнения.

Затем контейнер следует быстро запечатать и отправить. Все эти процедуры следует тщательно распределить по времени, чтобы минимизировать продолжительность транспортировки. Как правило, это означает работу во второй половине дня, чтобы забрать товар после обеда. См. протокол транспортировки ниже.

Сбор образцов тканей

Если предоставляются образцы тканей или фиксированные образцы кораллов, соблюдайте те же асептические методы, которые описаны выше, даже если это мертвый коралл или скелет. Образцы тканей Catalaphyllia можно легко получить с помощью скальпеля, бритвенного лезвия или острых ножниц. Образцы тканей обычно требуют некоторого удержания или манипуляций с кораллом, поэтому убедитесь, что используются перчатки или асептически очищенные руки. После получения образца ткани его следует немедленно поместить в фиксатор и запечатать. То же самое можно сделать с целой колонией, которая поражена. Колонию просто опускают в фиксатор. Я позабочусь обо всех последующих шагах после получения образца. Необходимое количество ткани должно быть не менее 1 см х 1 см и включать щупальца и ротовой диск, если это возможно и в более пораженных частях коралла. Пожалуйста, не присылайте образцы тканей без фиксации. Они быстро испортятся в морской воде и будут непригодны для исследования. Методы фиксации см. в инструкции к фиксатору.

Фотография

Я с благодарностью приму любую фотодокументацию каталафилии в больном состоянии. Это может помочь просто взять цифровую камеру в несколько рыбных магазинов и сделать несколько снимков. Я особенно благодарен за фотодокументацию кораллов, которые либо взяты на пробу, либо присланы мне живыми или зафиксированными. На самом деле, я был бы очень рад получить фотографии до получения кораллового материала, чтобы убедиться, что он находится в надлежащем состоянии. Я также буду признателен за любые дополнительные фотографии аквариума в целом, особенно в связи с кораллом элегантности. Если кто-то потерял коралл элегантности в таком состоянии, но сохранил скелет, я хотел бы увидеть его фотографии со всех сторон и очень крупным планом, если камера позволяет это сделать. Пожалуйста, не предоставляйте фотографии, которые не в фокусе или не показывают четко структуры или животных, которые фотографируются. Вы можете отправить цифровые или отсканированные изображения по электронной почте на указанный выше адрес. У меня нет практических ограничений на размер файлов, и у меня очень быстрый интернет дома и на работе, так что не сдерживайте себя в размере или количестве файлов. Пожалуйста, предоставьте следующую информацию о каждой фотографии:

Ваше имя Дата съемки Основное описание фотографии Контактная информация Если фотография сопровождает другие отправляемые материалы или является отдельной фотодокументацией.

Возможно, я задам другие вопросы после получения, но пока достаточно и этой информации.

Живые кораллы Пожалуйста, используйте ночную службу доставки и постарайтесь договориться о возможно более позднем времени получения, чтобы коралл провел как можно меньше времени в пути. Перед отправкой подтвердите со мной планируемые даты отправки, чтобы я мог быть уверен, что буду доступен или у меня есть кто-то свободный. Не отправляйте живых животных на адрес моей лаборатории, так как могут возникнуть значительные задержки, прежде чем они доберутся до моей лаборатории.

Отправляйте всех живых животных ко мне домой. Пожалуйста, свяжитесь со мной по электронной почте eborneman@uh.edu для получения моего домашнего адреса доставки. Вам не нужно требовать выдачи подписи. Все водители знают меня.

После подтверждения получения груза, пожалуйста, отправьте мне номер отслеживания по электронной почте eborneman@uh.edu.

Живые кораллы должны быть упакованы в пакеты или контейнеры и обеспечены, чтобы они не протекали. Настоятельно рекомендуется двойная упаковка или герметизация контейнеров. Убедитесь, что коробки хорошо изолированы арахисом или пенополистиролом, а если вы отправляете товар в холодную погоду, обязательно используйте тепловой пакет. Рыбный магазин, скорее всего, сможет предоставить такие пакеты и их количество, соответствующее климату в данный момент. Как правило, одного или двух будет достаточно для небольших коробок. Если погода очень холодная (или жаркая), пожалуйста, подождите до наступления более умеренных условий.

Неподвижные образцы тканей, скелеты и другие неживые материалы

Пожалуйста, отправьте их обычной наземной службой по вашему выбору по следующему адресу и убедитесь, что в случае наличия жидкостей, особенно спирта или других фиксаторов, контейнеры должны быть жесткими и хорошо закрытыми, желательно с завинчивающимися, а не защелкивающимися крышками. Если вы отправляете стеклянные контейнеры, убедитесь, что коробка хорошо упакована и набита, чтобы избежать поломки.

Эрик Борнеман Факультет биологии Хьюстонского университета Научно-исследовательский корпус II 4800 Calhoun Rd. Houston, TX 77204 Ph (713) 743-2667

Инструкции по фиксации

Ниже я вставил небольшой текст о фиксации из Histotechnique в информационных целях. Целью фиксации является постоянное сохранение тканей в состоянии, максимально похожем на жизнь. Фиксация должна проводиться как можно скорее после удаления тканей или вскоре после смерти, чтобы предотвратить автолиз. Идеального фиксатора не существует, хотя формальдегид подходит ближе всего. Поэтому можно использовать различные фиксаторы в зависимости от типа присутствующих тканей и особенностей, которые необходимо продемонстрировать. Существуют общие способы использования фиксаторов в патологоанатомической лаборатории, основанные на природе фиксаторов, типе ткани и гистологических деталях, которые необходимо продемонстрировать.

Формалин используется для всех обычных тканей, когда необходимо изготовить слайд H и E. Формалин – самый щадящий из всех фиксаторов, когда условия не идеальны, и нет ткани, которой он нанес бы значительный вред.

Существуют две основные группы фиксаторов для работы, необходимой в данном проекте, классифицированные по механизму действия:

Альдегиды включают формальдегид (формалин) и глутаральдегид. Ткани фиксируются за счет перекрестных связей, образующихся в белках, особенно между остатками лизина. Это сшивание не наносит большого вреда структуре белков, поэтому антигенность не теряется. Формалин хорошо проникает в ткани, но действует относительно медленно. Стандартным раствором является 10% нейтральный забуференный формалин, хотя для коралловых тканей подойдет и 10% формалин в морской воде. Существует ряд доступных фиксаторов, которые лучше, включая модифицированный раствор Хелли, рецепты параформальдегида и марку под названием Z-fix, которые особенно хороши для коралловых тканей. Если у кого-то есть доступ к этим химикатам, дайте мне знать по электронной почте, потому что это было бы лучше для большинства гистологических анализов, которые я буду использовать. Я могу предоставить подробные инструкции, если это то, что вы можете сделать.

Глутаральдегид фиксирует очень быстро, поэтому хорошо подходит для электронной микроскопии. Он очень плохо проникает, но дает наилучшую общую цитоплазматическую и ядерную детализацию. Стандартным раствором является 2% забуференный глутаральдегид. Я не ожидаю, что мне придется делать ЭМ на данном этапе, хотя в будущем, возможно, придется. Однако я могу использовать ткани от пораженных живых кораллов и не хочу, чтобы кто-то неквалифицированный использовал глутаральдегид. Это довольно неприятное вещество.

Спирты, включая метиловый спирт (метанол) и этиловый спирт (этанол), являются денатураторами белков и не используются в рутинной работе с тканями, поскольку вызывают слишком большую хрупкость и твердость. Спирты, в частности этанол, используются в основном для цитологических мазков. Этанол (95%) быстр и дешев. Поскольку толщина мазков составляет всего одну клетку или около того, нет большой проблемы с усадкой, а поскольку мазки не разрезаются, нет проблемы с индуцированной хрупкостью. Поскольку коралловая ткань имеет толщину всего в два клеточных слоя, спирт работает. Впоследствии с тканью трудно работать, и некоторые анализы невозможно выполнить, если в качестве фиксатора используется спирт, но при его использовании я смогу получить некоторые результаты. Они наиболее легко доступны для большинства людей. В идеале следует использовать этанол, приобретая небольшие бутылочки чистого зернового спирта в винном магазине и разбавляя его до 70% свежеприготовленной искусственной морской водой. Я бы использовал примерно 1/4 чайной ложки бикарбоната натрия (пищевой соды) в смеси, чтобы действовать как буфер, если объем фиксатора составляет около 250-500 мл (8-16 унций).

Объем фиксатора очень важен. Соотношение фиксатора и ткани должно быть 10:1. Поскольку кораллы имеют скелет, это необходимо учитывать, так как фиксатор будет впитываться в пористый скелет и не сможет проникнуть в ткани коралла.

Источники материалов

90%-ный протирочный (изопропиловый) спирт для стерилизации поверхности можно приобрести в большинстве крупных аптек.

70%-ный протирочный (изопропиловый) спирт для фиксации и менее эффективной поверхностной стерилизации можно приобрести в аптеках, супермаркетах, магазинах товаров первой необходимости и т.д.

99-100% этанол можно приобрести в виде чистого зернового спирта в винных магазинах. Он часто продается под названием Everclear. Этанол стоит того, чтобы приложить усилия для его приобретения, хотя он стоит дороже, чем спирт для растирания. Он очень хорошо стерилизует поверхности, быстро испаряется, гораздо лучше подходит для фиксации тканей и относительно нетоксичен для человека и организмов в аквариуме.

Стерильные тампоны, шприцы и контейнеры можно приобрести в некоторых аптеках и магазинах лабораторного оборудования. Большинство ветеринаров или ваш лечащий врач, скорее всего, захотят расстаться с некоторыми из них, если вы попросите их об этом.

Пожалуйста, свяжитесь со мной по электронной почте для получения дополнительной информации.

Поддержка исследования

Если вы не можете предоставить материал кораллов, но хотите поддержать исследование, помогая оплатить расходы, связанные с изучением состояния, вы можете сделать пожертвования в фонд проекта “Коралл элегантности”. Пожалуйста, отправляйте пожертвования в виде чека, денежного перевода или электронного платежа по следующему адресу. Средства будут храниться и использоваться по мере необходимости путем снятия со счета. Любые неиспользованные средства в размере более 10% от общей суммы пожертвования будут возвращены, если исследование будет завершено без использования всех средств. Возврат 10% от общей суммы пожертвования будет стоить дорого и потребует больших затрат, поэтому оставшиеся деньги будут либо сохранены для будущих проектов, либо переданы исследователю за его усилия в проекте, что будет определено по желанию жертвующей стороны.

В настоящее время я работаю над созданием фонда и вскоре размещу информацию об этом на Коралловом форуме.

Стоимость этой начальной фазы проекта будет напрямую зависеть от количества полученного материала. Стоимость материалов может варьироваться в зависимости от того, что уже имеется в наличии. По моим оценкам, средняя стоимость одного образца составляет:

Source: reefkeeping.com