Акваріумна хімія: Кругообіг азоту: Нові розробки та нові перспективи

Кругообіг азоту відіграє надзвичайно важливу роль у такому закритому середовищі, як акваріум. Завдяки його присутності можна підтримувати життя риб і безхребетних у невеликому життєздатному просторі, тому дуже важливо навчитися його пізнавати, головним чином, стосовно тих форм життя, які ми вирощуємо.

Ще кілька років тому вважалося, що кругообіг азоту у своїй складності є завершеним лінійним процесом. Однак, останні наукові відкриття значно перевернули наші усталені знання про кругообіг азоту і про мікроорганізми, які беруть участь у цих процесах. Фактично, глобальний кругообіг азоту в навколишньому середовищі, особливо в морському, був інтегрований принаймні трьома новими ланками, які включають

1. окислення амонію особливою групою мікроорганізмів – архебактеріями (AOA);
2. анаеробне відновлення нітратів до іонів амонію (DNRA);
3. процеси анаеробного окислення амонію (АНАММОКС).

У першій частині цієї статті я спробую розглянути суттєві і більш домінуючі аспекти азотного циклу: процеси перетворення основних компонентів (атмосферний азот, іон амонію, нітрити, нітрати) і роль, яку відіграють задіяні в них види бактерій.

У другій частині будуть досліджені нові шляхи з особливим акцентом на роль бактерій, зосереджуючись на наслідках, які ці нові відкриття принесли в глобальний кругообіг азоту.

Канонічний кругообіг азоту

Азот (N) є основною поживною речовиною для всіх організмів, він є критично важливим елементом білка, вітамінів і ДНК, а також відіграє важливу роль у біохімічних структурах і процесах, які визначають життя.

Азот існує в різних ступенях окислення та в багатьох хімічних формах і швидко перетворюється мікроорганізмами як на землі, так і в морі.

У морському середовищі азот присутній у 5 формах:

1. Газоподібний азот (N₂), стабільні молекули, які потребують спеціалізованих ферментних систем (присутніх у деяких видах бактерій) для фіксації та подальшого використання;
2. Іон амонію (NH₄ + ), найбільш відновлений природний вид азоту і найбільш біологічно доступний у безкисневому середовищі;
3. Нітрат-іон (NO₃ – ), найбільш окислена форма азоту, найбільш придатна для використання в аеробному середовищі;
4. Частинки органічного азоту (PON), органічна форма азоту, що переважає в донних відкладеннях;
5. Розчинений органічний азот (DON), багата суміш молекул з широким діапазоном складу.

Рисунок 1. Схема кругообігу морського азоту.

Складна мережа реакцій пов’язує ці форми азоту в процеси, які в цілому називають кругообігом азоту (рис. 1). Найбільше джерело азоту надходить у вигляді інертного газу N₂ (N ≡ N), що становить 78% атмосфери. Невелика частина атмосферного N₂ фіксується особливими бактеріями, які називаються азотфіксуючими (азотфіксаторами), і відновлюється до іону амонію (NH₄ + ), який може бути легко використаний іншими організмами. У морському середовищі, яке населяють певні бактерії, амоній швидко окислюється до нітратів в аеробних умовах (нітрифікація). Потім нітрат знову відновлюється до газу N₂ в анаеробних умовах (денітрифікація), таким чином завершуючи цикл (рис. 1).

Фіксація азоту та амоніфікація

Фіксація азоту

Біологічну фіксацію азоту синтетично можна представити наступною глобальною формулою:

Це означає, що на кожну молекулу атмосферного азоту утворюється 2 іони амонію з поглинанням 6 електронів і 6Н+, цей останній процес має тенденцію до підвищення рН.

Цікаво відзначити, що, в кінцевому рахунку, іон амонію у воді знаходиться в рівновазі з аміаком (NH3) на основі наступної стехіометрії:

Концентрація цих двох хімічних видів значною мірою залежить від рН, тобто чим вища лужність, тим більшою буде кількість аміаку; або пропорційно, чим нижчий рН (більш кислий), тим більшою буде кількість іонів амонію (менш токсичний, ніж аміак). Як видно з рисунку 2, в середньому діапазоні рН морської води відсотковий вміст NH4+ вищий (82-97%) порівняно з NH3 (3-18%).

Як ми вже зазначали раніше, атмосферний азот N₂перед включенням в біологічні молекули, повинен бути відновлений до NH₄ + через серію реакцій, які називаються біологічною фіксацією азоту. Такі реакції каталізуються особливим ферментом – нітрогеназою, який присутній у деяких азотфіксуючих бактерій, що належать переважно до Cyanobacteria phylum. Однією з особливостей цього ферменту є те, що він незворотно інгібується молекулярним киснем (O₂), а оскільки фіксація відбувається в аеробному середовищі, це створює видимий парадокс. Насправді ж ціанобактерії здатні узгоджувати активність нітрогенази, ферменту, який по суті є анаеробним, з неминучою присутністю кисню (що утворюється в результаті фотосинтетичних процесів), за допомогою ще не відомих механізмів. У морському середовищі азотфіксуючі бактерії (деякі з них також належать до родів Clostridium та Azobacter) можуть зустрічатися як у вільному вигляді, так і в симбіозі з іншими організмами (наприклад, губкою).

Рисунок 2. рН-залежна концентрація NH4+ та NH3 у морській воді

Але що є джерелом азоту в акваріумі? Безумовно, біологічна фіксація азоту є надзвичайно важливим процесом в океані, але в акваріумі вона має обмежену роль.

Основним джерелом азоту є харчування як риб, так і безхребетних, особливо у вигляді білка і окремих амінокислот, за умови їх безпосереднього введення в акваріум. Навіть незначні вітаміни та інші молекули, такі як ДНК, містять азот, але його кількість значно менша, ніж у білках. У білках азот входить до складу каркасу та бічних ланцюгів деяких окремих амінокислот, таких як триптофан, аспарагін, глутамін, лізин, аргінін, гістидин.

Окислювальна деградація амінокислот призводить до виділення аміачного азоту в резервуар. Яким чином? З одного боку, білок, який споживається рибою або іншими організмами, розщеплюється на окремі амінокислоти. У свою чергу, амінокислоти можуть бути використані для побудови нових білків в організмі або окислені для отримання енергії. Деградація амінокислот тваринами призводить до усунення різноманітних побічних продуктів. Наприклад, риби виділяють азот у вигляді аміаку, тоді як більшість організмів можуть виділяти його у вигляді сечової кислоти (птахи, рептилії) або сечовини (людина). З іншого боку, за наявності сильного органічного заряду, білок та амінокислоти у відходах, в осадах та при органічному розпаді розкладаються в процесі, який називається амоніфікацією, що здійснюється певними бактеріями-розкладачами, які вивільняють амоній у воду шляхом деградації амінокислотного азоту.

Нітрифікація

Нітрифікація відбувається в два окремих етапи:

1. окислення амонію до нітритів (нітрозування) та
2. окислення нітритів до нітратів (нітрація).

1) Нітрозування: на першому етапі іон амонію окислюється до нітриту в два етапи:

1. Перший етап каталізується ферментом монооксигеназою, який утворює гідроксиламін, використовуючи O₂ в якості окислювача: 2NH₄ + + O₂ → 2NH₂OH + 2H +
2. На другому етапі гідроксиламін окислюється до нітритів за допомогою ферменту гідроксиламіндегідрогенази: 2NH₂OH + 2O₂ → 2H + + 2H₂O + 2NO₂ –

2) Нітрація: окислення нітритів до нітратів, яке відбувається завдяки активності ферменту нітритоксидази, завершує процес нітрифікації:

Загальноприйняте уявлення про те, що нітрифікація відбувається в присутності кисню і передбачає окислення амонію до нітратів за наступною глобальною синтетичною формулою (див. рисунок 1):

Але хто керує музикою? Метаболічна робота з нітрифікації покладена на дві групи нітрифікуючих бактерій:

1. бактерії, які окислюють амоній (амонійно-окислювальні бактерії або АОБ), які також називають нітрифікуючими бактеріями. Вони належать переважно до видів Nitrosococcus та Nitrosomonas;
2. бактерії, які окислюють нітрити (Nitrite-oxidizing bacteria або NOB), також звані азотобактеріями. Вони входять до складу видів Nitrobacter, Nitrococcus та Nitrospina.

Нітрифікуючі бактерії, як правило, є облігатними аеробами та облігатними хемоавторофами, оскільки вони безпосередньо використовують CO₂ як джерело вуглецю, тоді як органічні речовини можуть бути токсичними.

Денітрифікація

Тут я детально описую чотири стадії процесу денітрифікації. Ступінь окислення азоту вказана в дужках, після назв хімічних видів.

1. Відновлення нітрату (+5) до нітриту (+3). Ця реакція каталізується нітратредуктазою (NAR), яка існує у (внутрішній) цитоплазматичній частині бактеріальної мембрани. Нітрат переноситься всередині бактеріальної клітини спеціалізованим переносником (AP на рисунку 3), який визначається як антипорт, оскільки він обмінює іон нітрату при вході на нітрит, який утворюється в ході реакції і повинен бути перенесений в (зовнішній) периплазматичний простір для подальшої реакції. 2NO₃ – + 4H + + 4e – → 2NO₂ – + 2H₂O
2. Відновлення нітриту (+3) до оксиду азоту (+2). Нітрит, який тепер знаходиться в периплазматичному просторі, відновлюється нітритредуктазою (НІР), вивільняючи оксид азоту (NO). NO є надзвичайно важливою молекулою, від бактерій до людини (але це вже інша історія). 2NO₂ – + 4H + + 2e – → 2NO + 2H₂O
3. Відновлення оксиду азоту (+2) до оксиду азоту (+1). NO відновлюється за допомогою редуктази оксиду азоту (NOR) до закису азоту (також званого протооксидом азоту, інакше відомого як звеселяючий газ). Обидва оксиди є сильним стимулом для синтезу редуктази в присутності нітратів і в анаеробних умовах. 2NO + 2H + + 2e – → N₂O + H₂O
4. Відновлення закису азоту (+1) до газоподібного азоту (0). Останньою реакцією в процесі денітрифікації є відновлення закису азоту до молекулярного азоту в газоподібній формі за допомогою редуктази закису азоту. Ця реакція повинна завершити процес денітрифікації і завершити кругообіг азоту. N₂O + 2H + + 2e – → N₂ + H₂O

Денітрифікація є одним з ключових процесів у кругообігу азоту і передбачає відновлення нітратів до газоподібного азоту, проходячи через нітрити, оксид азоту (монооксид азоту) та закис азоту (протооксид азоту).

Глобальну реакцію денітрифікації (без урахування органічної молекулярної деградації, яка в кінцевому підсумку пов’язана з нею) можна синтезувати за допомогою наступної формули (докладніше див. рис. 1):

Рисунок 3. Процес денітрифікації на бактеріальній мембрані.

Денітрифікація є переважно гетеротрофним варіантом і відбувається в анаеробних умовах. Широкий спектр бактерій, які називаються саме денітрифікуючими бактеріями, здатні здійснювати всю послідовність реакцій, будучи оснащеними повноцінним ферментним апаратом.

Денітрифікуючі бактерії здатні здійснювати анаеробне дихання нітратів, використовуючи нітрат замість кисню, як акцептор електронів, що вивільняються в процесі дихання. Ці бактерії мають спеціальні ферменти (рис. 3), такі як нітратредуктаза (NAR) і нітритредуктаза (NIR), які дозволяють електронам рухатися до нітрату або нітриту за відсутності кисню. Це гнучкі ферменти, які утворюються в клітинній мембрані тільки в анаеробних умовах: власне, частина НАР, редуктаза, синтез якої пригнічується в присутності кисню.

Деякі види бактерій класів Pseudomonas, Thiobacillus, Paracoccus і Naisseria вважаються денітрифікаторами.

Нові розробки та нові перспективи

Попередній опис являє собою давно відомий сценарій. Однак протягом останніх років наші уявлення про кругообіг азоту кардинально змінилися до такої міри, що сам принцип замкнутого лінійного циклу ставиться під сумнів. Це пов’язано з тим, що були відкриті нові реакції і, відповідно, нові мікроорганізми, які роблять весь кругообіг азоту ще більш складним і закрученим (рис. 4). У другій частині цієї статті я спробую прояснити деякі важливі шляхи, які будуть вставлені в канонічний кругообіг азоту:

1. Окислення амонію особливою групою мікроорганізмів – архебактеріями (АОА)
2. Анаеробне відновлення нітратів до амонію (DNRA):
3. Процеси анаеробного окислення амонію (ANAMMOX)

АОА: Архебактерії, що окислюють амоній

Нещодавно були виявлені нові важливі компоненти кругообігу азоту, які входять до складу найбагатшої та найрозповсюдженішої групи мікроорганізмів на планеті – архебактерій. Незважаючи на те, що еволюційна лінія цієї групи є неясною, архебактерії (Archaea або Archeobacteria) разом з еукаріотами та еубактеріями є одними з фундаментальних доменів живих істот.

Рисунок 4: Кругообіг азоту, інтегрований з нещодавно відкритими реакціями. Підкреслені ступені окислення азоту.

Архебактерії, як і бактерії, складаються з одноклітинних організмів без ядра, і в минулому їх разом з бактеріями відносили до прокаріотів. На основі аналізу ДНК архебактерії були перегруповані в три філи: Crenarchaeota, Euryarchaeota і Korarchaeota. Бактерії Euryarchaeota є найбільш відомими і включають продуцентів метану та холофілів. Бактерії Crenarchaeota включають термофільні мікроорганізми, в той час як бактерії Korarchaeota менш відомі, оскільки визнана тільки їх ДНК, але жоден мікроорганізм досі не був виділений. Спочатку вважалося, що архебактерії – це просто мешканці суворого і найбільш ворожого середовища на земній кулі. Термофіли можуть рости при температурі вище 100°C, психрофіли – при температурі нижч е-10°C, ацидофіли та алкаліфіли – в надзвичайно кислому або лужному середовищі відповідно. Нарешті, галофіли віддають перевагу сильно засоленому середовищу. Сьогодні відомо, що архебактерії присутні у всіх середовищах існування: наприклад, бактерії Crenarchaeota вважаються повсюдними компонентами зоопланктону.

Малюнок 5. Дерево життя. Лінії еволюції основних доменів.

У 2004 році у морських Crenarchaeota був виявлений особливий ген під назвою амонійна монооксигеназа (amoA), що вказує на здатність окислювати амоній. Однозначний і переконливий зв’язок між цим новим геном і окисленням амонію у архебактерій був нещодавно встановлений у Crenarchaeota, Nitrosopumilus maritimus, який був виділений з води акваріума. N. maritim us є хемоавтотрофом: фактично він росте на бікарбонаті як єдиному джерелі вуглецю (органічний вуглець пригнічує його ріст) і перетворює NH₄ + в NO₂– (зелена лінія на Рисунку 4 та Рисунку 7). Інші архебактерії були послідовно ідентифіковані з цією властивістю і були названі амонійокислюючими архебактеріями (AOA). Точний аналіз гена AmoA у багатьох архебактерій виявив різноманітні ізоформи цього гена, кожна з яких пов’язана з мікроорганізмом, присутнім у різних середовищах існування (з невеликим перекриттям, наприклад, між осадом і товщею води). Також були виявлені архебактерії-симбіонти, як, наприклад, Cenarchaeum symbosiosum, симбіонт Crenarchaeota з губкою. Дивно, але було помічено, що ця архебактерія не здатна виробляти гідроксиламін як проміжну реакцію (див. процес нітрозування у ВСТАВЦІ 2), що вказує на те, що окислення амонію відбувається за механізмом, який відрізняється від механізму класичної нітрифікації. Нарешті, останні дослідження показують, що більшість Crenarchaeota є AOA, а AOA – це мікроорганізми, чисельність яких чисельно переважає в океані.

DNRA

Протягом останніх років анаеробне відновлення нітратів/нітритів, DNRA (абревіатура від D issimilatory N itrate/nitrite R eduction to A mmonium) викликає певний інтерес як актуальна реакція як в наземних, так і в морських екосистемах. Реакція була описана в аноксидних відкладах і в присутності бактерій видів Thioploca і Thiomargarita. Обидва види бактерій здатні концентрувати нітрати у власних клітинах для подальшого окислення сірковмісних сполук у відновлену форму. Таким чином, вони здатні відновлювати нітрати до амонію, проходячи через нітрит як проміжну сполуку (синя лінія на рис. 4 та рис. 7). Ця реакція, хоча все ще потребує уточнення, потенційно може забезпечити нітрит і амоній для реакції ANAMMOX (див. наступний параграф) в аноксидних відкладеннях.

ANAMMOX: анаеробне окислення амонію

Як ми вже бачили раніше в описі стадій Амонійного окислення та нітрифікації, окислення амонію є суто аеробним процесом. Насправді, ми також бачили, що амоній може утворюватися в гіпоксичному та аноксидному середовищі (наприклад, у донних відкладеннях) шляхом ремінералізації органічного азоту (амоніфікація), та/або анаеробного відновлення нітритів (DNRA). Протягом багатьох років вважалося, що амоній є інертним в анаеробних умовах, тобто марним для живих істот. Проблема, однак, полягає в тому, що не було виявлено бактерій, здатних метаболізувати амоній без доступу кисню, особливо через технічну складність культивування в лабораторії штамів бактерій з такими характеристиками. У 2008 році багато з цих труднощів було подолано і деякі лабораторії змогли ідентифікувати, культивувати та охарактеризувати деякі види бактерій ANAMMOX (скорочення від AN aerobic AMM onium OX idation), які здатні окислювати амоній до газоподібного азоту (N₂) (червона лінія на рис. 4 та рис. 7), використовуючи нітрит як акцептор електронів замість кисню.

Перші бактерії, які були виділені в морському середовищі, належать до виду Scalindua (Sc. sorokinii), хоча в даний час проводяться дослідження щодо наявності інших видів, таких як Brocadia та Kuenenia. Загальною характеристикою цих бактерій, унікальних у своєму класі, є наявність спеціалізованої органели під назвою анаммоксосома, яка оточена особливим ліпідом (жиром), що містить гідразиноксидредуктазу – ексклюзивний фермент, який здатний поєднувати нітрит та амоній за один крок (рис. 6). Ці бактерії використовують досить складний механізм, який включає в себе гідразин в якості посередника. Однак, наступна реакція, яка є неповною і стехіометрично неточною, може наштовхнути на думку про процес ANAMMOX.

Рисунок 6. Бактерія ANAMMOX

Вперше ця реакція була описана у зразках донних відкладів, взятих з певних морських екосистем (наприклад, Чорного моря). Було помічено, що в тих експериментальних умовах процес ANAMMOX був відповідальний за втрату 30-50% неорганічного азоту з моря (у вигляді N₂), що суттєво ставить його в один ряд з класичною денітрифікацією. Але якщо уважно проаналізувати, то якщо пов’язати вищезгаданий процес DNRA з ANAMMOX, то маємо реальну і фактичну анаеробну денітрифікацію, явно не канонічну. Дійсно, DNRA постачає нітрити (як проміжний продукт реакції, що починається з нітратів) і амоній (останній отриманий також шляхом амоніфікації органічного азоту), а ANAMMOX перетворює все в газоподібний азот. Прекрасна і хороша денітрифікація, явно з іншими механізмами і штамами бактерій, але тим не менш, денітрифікація.

Тепер питання: чи може в аналогічних умовах відбуватися АНАММОКС в акваріумі? Очевидно, що ми не в змозі це встановити, але ми можемо висловити деякі міркування. Привідний DSB може відтворити оптимальні умови для цього процесу. Насправді, бульбашки азоту видно в глибині осаду. Відповідно до цього, експериментально було помічено (але не в акваріумі), що чим вище шар осаду, тим більше нагнітається аноксидний стан (кисень гальмує реакцію) і тим швидше відбувається реакція. Тому висока ефективність DSB у видаленні нітратів може бути також обумовлена неканонічною денітрифікацією, окрім класичної анаеробної денітрифікації; очевидно, що остаточна наявність кваліфікованих штамів бактерій ще має бути визначена. На рисунку 7 показано принципову схему інтегрованого циклу азоту з новими реакціями та областями, в яких вони відбуваються.

Рисунок 7. Переглянутий та інтегрований кругообіг азоту. Області, в яких відбуваються реакції, показані наочно.

На закінчення можна сказати, що ці постійні відкриття прояснюють багато незрозумілих моментів азотного циклу, але в той же час вони відкривають нові горизонти і парадигми, які роблять ці процеси ще більш складними і захоплюючими. З іншого боку, я сподіваюся, що цією статтею я не ускладнив усталені уявлення про кругообіг азоту. Я також бажаю, щоб з часом ці нові відкриття можна було застосувати та інтегрувати з акваріумом, незважаючи на нечисленні наукові дослідження в цій галузі. Однак, навіть якщо ці знання будуть лише теоретичними, вони дозволять нам краще зрозуміти те, що може відбуватися в наших акваріумах, і підтримувати нашу пристрасть до акваріумістики.

Список використаної літератури

1. Арріго К. Р. (2005) Морські мікроорганізми та глобальні кругообіги поживних речовин. Природа 437: 349-355.
2. Берман-Франк І., Лундгрен П., Фальковський П. (2003) Азотфіксація та фотосинтетична еволюція кисню у ціанобактерій. Рез.мікробіол. 154: 157-164.
3. Brandes J. A., Devol A. H., & Deutsch C. (2007) Нові розробки в морському азотному циклі. Chem.Rev. 107: 577-589.
4. Френсіс К. А., Беман Я. М., і Куйперс М. М. (2007) Нові процеси та гравці в кругообігу азоту: мікробна екологія анаеробного та археального окислення аміаку. ISME.J. 1: 19-27.
5. Джеттен М. С. (2008) Мікробний азотний цикл. Environ.Microbiol. 10: 2903-2909.

Подяки

Марко Коласанті aka marcola62 (модератор форуму Reefitalia). Особлива подяка співробітникам спільноти ReefItalia за підтримку.

Про автора

МАРКО КОЛАСАНТІ народився в Римі, Італія, 15 вересня 1962 року, має вищу біологічну освіту та ступінь доктора філософії в галузі неврології. На даний час є професором кафедри клітинної біології біологічного факультету Римського університету, Італія. Викладає курси клітинної біології та лабораторію клітинної біотехнології для здобуття університетського ступеня біолога. Почав займатися акваріумістикою з прісноводних акваріумів (1982 р.) і створив свій перший морський акваріум у 1995 році. В даний час він є співробітником і модератором ReefItalia, італійської рифової спільноти. Протягом останніх п’ятнадцяти років активно займається науковими дослідженнями шляху оксиду азоту (NO) в різних моделях та системах, включаючи риб та безхребетних. Співавтор понад 70 публікацій у міжнародних рецензованих журналах та книгах ISI.

Source: reefs.com