Светящаяся зеленая Нобелевка

Когда Осаму Шимомура жарким летним днем 1961 года собирал свою тысячную за день медузу, он и не подозревал, что эта кропотливая работа в итоге принесет ему Нобелевскую премию. Но открытие Шимомурой зеленого флуоресцентного белка (GFP), сделанное в том же году, положило начало целой серии разработок, которые произвели революцию в том, как мы смотрим внутрь клеток.

В этом году Нобелевскую премию по химии с ним разделили два человека – Мартин Чалфи и Роджер Тсьен. Каждый из них сыграл решающую роль в превращении необычного белка медузы в соединения, которые регулярно используются в лабораториях клеточной биологии по всему миру и продолжают давать новые знания о таких заболеваниях, как рак, ВИЧ и болезнь Альцгеймера.

Великая охота на медуз

Шимомура родился в Японии в 1928 году, и его ранняя жизнь была омрачена войной. Он находился всего в 12 километрах от атомной бомбы, упавшей на Нагасаки, – достаточно близко, чтобы временно ослепнуть от вспышки.

Его упорное стремление к научной карьере в конце концов было вознаграждено получением степени доктора философии в Университете Нагои за открытие белка, ответственного за свечение обитающего в море светлячка. Эта работа привлекла внимание Фрэнка Джонсона из Принстонского университета в США, который пригласил его для изучения зеленой светящейся медузы Aequorea victoria в рамках проекта, который продолжался более 20 лет.

Каждое лето Шимомура отправлялся в бухту Пятница Харбор, остров Сан-Хуан, штат Вашингтон, когда море становилось густым от медуз. В 1961 году он извлек тускло светящиеся кольца примерно из 10 000 медуз размером с мышь и пропустил их через фильтр. Выделив из светящегося “сквизата” белок, Шимомура с удивлением обнаружил, что он излучает синий, а не зеленый свет. Это, как оказалось, был экворин – белок, излучающий синий свет в присутствии ионов кальция.

Шимомура понял, что что-то еще преобразует этот синий свет в зеленое свечение. В конце концов он выделил второй белок, который был способен поглощать как синий, так и ультрафиолетовый свет, а затем флуоресцировать зеленым цветом. Этот белок был назван зеленым флуоресцентным белком (GFP) – это простое название прижилось.

В течение следующих 17 лет Шимомура продолжал собирать медуз, чтобы определить химический состав светящихся белков. Нам нужно было много материала, поэтому по графику мы должны были ловить около 50 000 медуз каждое лето”, – говорит Шимомура. Так что в общей сложности мы, вероятно, собрали более 850 000″.

Из этой огромной коллекции в 1979 году Шимомура наконец-то смог определить химическую структуру хромофора GFP и заложить основу для будущих открытий.

Слева направо: Роджер Тсьен, Осаму Шимомура и Мартин Чалфи

Видеть сквозь него

В 1988 году Мартин Чалфи, ученый-биолог из Колумбийского университета в Нью-Йорке, посетил семинар, на котором вскользь упоминался GFP. Чалфи вспоминает, что идея флуоресцентного белка так его взволновала, что он не слушал других докладчиков в тот день.

Причина, по которой я был так взволнован, заключалась в том, что я работал над круглым червем длиной в миллиметр под названием C. elegans, который является прозрачным”, – говорит Чалфи. Я понял, что если я смогу экспрессировать флуоресцентный белок в круглом черве, то смогу наблюдать за клеточными процессами под микроскопом”.

Чалфи нужно было найти ген, ответственный за производство GFP, и ему не потребовалось много времени, чтобы найти человека, который работал над этим – биолога по имени Дуглас Прашер из Вудсхоулского океанографического института в Массачусетсе.

Прашер первым придумал, как GFP может функционировать в качестве флуоресцентной метки. Будучи достаточно маленьким, чтобы не мешать действию других белков, и чувствительным к ультрафиолетовому свету, Прашер решил, что GFP идеально подходит для отслеживания раковых клеток. К 1992 году он выделил ген GFP и опубликовал работу с подробным описанием последовательности 238 аминокислот, входящих в состав белка.

Узнав о результатах Прашера, Чалфи решил поручить своему аспиранту Гии Эускирхену начать работу по внесению гена GFP в генетический код бактерий E. coli. Всего через месяц Эускирхену удалось добиться успеха – он получил клетки кишечной палочки, которые ярко светились, несмотря на то, что не имели ни одного из других ферментов медузы, которые считались необходимыми.

Многие организмы светятся естественным образом, например, светлячки или тропические рыбы, но в большинстве случаев в этих процессах участвуют другие компоненты, которые расходуются во время свечения. Чалфи обнаружил, что GFP уникален – сам белок является всем, что необходимо для преобразования ультрафиолетового света в яркий оттенок зеленого.

В генах

Чалфи говорит, что удача сыграла свою роль в победе в гонке по экспрессии гена. По крайней мере три другие команды пытались экспрессировать GFP до нас, но все их попытки были неудачными. Позже мы выяснили, что это было связано с тем, что они использовали немного другой процесс”.

В то время как команда Чалфи амплифицировала только точную последовательность, другие вырезали фрагменты соответствующего размера из клона Прашера. Однако при этом на обоих концах нити оставались небольшие фрагменты последовательности, которые мешали правильному формированию белка.

Несмотря на достигнутый успех, Чалфи все еще был удивлен успехами, к которым привел GFP. Я, конечно, понимал, что прикрепление флуоресцентных меток к подмножеству клеток может быть важным. Но чего я никогда не мог предположить, так это всех замечательных адаптаций и модификаций, которые придумали другие, что действительно превратило GFP в полезный и эффективный инструмент”.

Только после того, как в 1994 году Роджер Тсьен стал участником проекта, были найдены объяснения поведения GFP. Тсьен уже был известен в этой области тем, что позволил получить беспрецедентный вид изнутри клеток, например, разработав красители, которые меняют цвет при контакте с ионами кальция.

Джереми Сандерс, который руководил работой Тсиена во время защиты докторской диссертации в Кембриджском университете (Великобритания), говорит, что работа, проделанная Тсиеном до его исследования GFP, “открыла совершенно новый мир для изучения того, что происходит внутри живых клеток”. В какой-то момент в 1980-х годах почти треть всех статей, опубликованных в области физиологии, ссылалась на работу Тсиена”.

Для начала Тсьен составил схему того, как хромофор GFP формируется в цепочке из 238 аминокислот. Секрет заключается в том, как белок сворачивается в бочкообразную форму с тремя ключевыми аминокислотами (последовательность серин-тирозин-глицин), плотно прилегающими друг к другу в центре. Тсьен показал, как эти три аминокислоты могут реагировать с кислородом окружающей среды, создавая флуоресцентный хромофор.

Затем он приступил к работе над усовершенствованием. Дикий тип GFP был создан для собственных целей медузы, поэтому он явно не подходил для наших целей”, – говорит Тсьен, отмечая, что GFP имеет тенденцию терять способность светиться со временем, а зеленый цвет не всегда идеально подходит для практических исследований.

Мы обнаружили, что конкретная аминокислота может изменить основной цвет излучения, но другие аминокислоты также играют меньшую роль”, – объясняет он. Постепенно внося мутации в ген для тщательного изменения аминокислот, Тсьен смог настроить GFP для создания широкой палитры цветов и улучшения общей яркости.

Новые цвета стали важным шагом вперед, поскольку они позволили ученым одновременно получать изображения нескольких различных клеток и изучать взаимодействие различных систем в режиме реального времени.

Над мозгом

Единственное, что еще не удалось сделать Тсиену, – это получить свет в красной части спектра – это очень полезно, поскольку он легче проникает в биологические ткани. Поворотный момент наступил, когда Сергей Лукьянов из Института биоорганической химии имени Шемякина в Москве (Россия) обнаружил в кораллах белок, похожий на GFP, который был назван DsRED.

Источник: © AFP/GETTY IMAGES

Мозговая радуга оказалась уникальной цветокодированной картой мозга

“Красные белки из кораллов были крупнее и имели склонность к образованию тетрамеров, поэтому их нужно было сильно модифицировать, чтобы сделать удобными для использования”, – говорит Тсиен. В результате была создана новая серия белков с названиями mPlum и mStrawberry, обозначающими различные оттенки”.

Возможно, самая яркая демонстрация нового семейства произошла, когда команда Гарвардского университета под руководством Джеффа Лихтмана в 2007 году окрасила нейроны мышей в калейдоскоп из 90 различных цветов, что дало им возможность искать уникальные узоры.

Горько-сладкая премия

По правилам Нобелевской премии ее могут получить не более трех человек. И, как и во многих других важных открытиях, в разработку GFP внесли вклад больше ученых. В этом году человек, который клонировал и секвенировал ген GFP, и который первым представил себе его потенциал, Дуглас Прашер, не получил эту самую престижную награду. Гораздо хуже то, что карьера Прашера была прервана. Он не смог найти финансирование для своих исследований и полностью ушел из науки. Сейчас он работает водителем автобуса.

То, что Даг не получил признания, конечно, придает премии горько-сладкий оттенок, – говорит Чалфи. Я думаю, что для Нобелевского комитета это было мучительным решением, и они вполне могли бы дать премию Дагу, а не мне”.

Тсьен также признает вклад Прашера, говоря: “Очень жаль, что Даг в последнее время не может заниматься наукой. Я надеюсь, что вся эта огласка приведет к тому, что Даг снова сможет заниматься тем, в чем он действительно талантлив”.

Вопрос о том, не слишком ли большое место биология занимает в Нобелевской премии по химии, поднимается почти каждый год. Наша работа, безусловно, лежит на границе между химией и биологией, но мы делали эту работу не для того, чтобы получить Нобелевскую премию – мы делали ее потому, что в то время она была важна и интересна с научной точки зрения”, – говорит Тсьен.

Чалфи согласен с этим и считает, что его работа находится на границе между науками. Я думаю, что барьеры между различными научными департаментами становятся все более и более проницаемыми. И я думаю, что Шведская академия, безусловно, признала это здесь”. Без химии GFP огромный спектр важных биологических приложений был бы невозможен.

Source: rsc.org