Зелений Нобель, що світиться

Коли Осаму Шимомура збирав свою тисячну за день медузу спекотного літнього дня 1961 року, він і гадки не мав, що ця кропітка робота врешті-решт принесе йому Нобелівську премію. Але відкриття Шимомурою зеленого флуоресцентного протеїну (GFP), зроблене ним пізніше того ж року, започаткувало низку розробок, які докорінно змінили наші уявлення про клітини.

Двоє чоловіків, які розділили з ним Нобелівську премію з хімії цього року, – Мартін Чалфі та Роджер Тсьєн. Кожен з них відіграв вирішальну роль у перетворенні незвичайного білка медузи на сполуки, які регулярно зустрічаються в лабораторіях клітинної біології по всьому світу і продовжують давати нові знання про такі захворювання, як рак, ВІЛ і хвороба Альцгеймера.

Велике полювання на медуз

Шимомура народився в Японії в 1928 році, і його раннє життя було зруйноване війною. Він був лише за 12 кілометрів від атомної бомби, яка впала на Нагасакі – досить близько, щоб тимчасово осліпнути від спалаху.

Його рішуче прагнення до наукової кар’єри зрештою було винагороджено отриманням ступеня доктора філософії в Університеті Нагої за відкриття білка, відповідального за світіння морського світлячка, що мешкає в морі. Ця робота привернула увагу Френка Джонсона з Прінстонського університету в США, який залучив його до вивчення медузи Aequorea victoria, що світиться зеленим кольором, у проекті, який триватиме понад 20 років.

Щоліта Шимомура виходив у бухту П’ятничної гавані на острові Сан-Хуан, штат Вашингтон, коли море ставало густим від медуз. Протягом 1961 року він витягнув ледь помітні кільця, що світяться, з близько 10 000 медуз розміром з мишу і розчавив їх через фільтр. Виділивши білок із світящогося “сквізату”, Шимомура з подивом виявив, що він випромінює синє світло, а не зелене. Це, як виявилося, був екворин – білок, що випускає синє світло в присутності іонів кальцію.

Шимомура зрозумів, що щось інше перетворює це синє світло в зелене світіння. Зрештою він виділив другий білок, який був здатний поглинати як синє світло, так і ультрафіолетове, а потім флуоресціювати зеленим кольором. Цей білок був названий зеленим флуоресцентним білком (GFP) – це була проста назва, яка прижилася.

Протягом наступних 17 років Шимомура продовжував збирати медуз, щоб визначити хімічний склад білків, що світяться. “Нам потрібно було багато матеріалу, тому наш графік вимагав, щоб ми ловили близько 50 000 медуз щоліта”, – говорить Шимомура. “Таким чином, в цілому ми, ймовірно, зібрали понад 850 000”.

На основі цієї великої колекції Шимомура нарешті зміг охарактеризувати хімічну структуру хромофора GFP в 1979 році і закласти основу для майбутніх відкриттів.

Зліва направо: Роджер Тсьєн, Осаму Шимомура і Мартін Чалфі

Бачити наскрізь

У 1988 році Мартін Чалфі, вчений-біолог з Колумбійського університету в Нью-Йорку, відвідав семінар, під час якого коротко згадали про GFP. Чалфі згадує, що був настільки захоплений ідеєю флуоресцентного білка, що в той день не слухав інших доповідачів.

“Причина мого захоплення полягала в тому, що я працював над міліметровим круглим черв’яком під назвою C. elegans, який є прозорим, – розповідає Чалфі. Я зрозумів, що якщо зможу експресувати флуоресцентний білок в цьому черв’яку, то зможу спостерігати за клітинними процесами під мікроскопом”.

Чалфі потрібно було знайти ген, відповідальний за вироблення GFP, і він швидко знайшов того, хто над цим працював – біолога Дугласа Прашера з Вудс-Хольського океанографічного інституту в штаті Массачусетс.

Прашер був першим, хто передбачив, як GFP може функціонувати в якості флуоресцентної мітки. Будучи досить малим, щоб не перешкоджати дії інших білків і реагувати на ультрафіолетове світло, Прашер вирішив, що GFP буде ідеальним для відстеження ракових клітин. До 1992 року він виділив ген GFP і опублікував статтю, в якій детально описав послідовність 238 амінокислот, що входять до складу білка.

Почувши про результати Прашера, Чалфі вирішив доручити своєму аспіранту Гхіа Еускірхену розпочати роботу з вбудовування гена GFP в генетичний код бактерії E. coli. Лише через місяць Еускірхену це вдалося – він отримав клітини кишкової палички, які яскраво світилися, незважаючи на те, що не мали жодного з інших ферментів медузи, які, як вважалося, були необхідні для цього.

Багато організмів флуоресціюють природним чином, наприклад, світлячки або тропічні риби, але більшість цих процесів включають інші компоненти, які витрачаються під час люмінесценції. Чалфі виявив, що GFP був унікальним – сам білок був усім, що було потрібно для перетворення ультрафіолетового світла в яскравий відтінок зеленого.

У генах

Чалфі каже, що не останню роль у перемозі в гонці за експресію гена зіграло везіння. “Щонайменше три інші команди намагалися експресувати GFP до нас, але всі їхні спроби не увінчалися успіхом. Пізніше ми з’ясували, що це було пов’язано з тим, що вони використовували дещо інший процес”.

У той час як команда Чалфі ампліфікувала тільки точну послідовність, інші вирізали фрагменти відповідного розміру з клону Прашера. Однак це залишило невеликі фрагменти послідовності, прикріплені до обох кінців нитки, які заважали правильному утворенню білка.

Незважаючи на досягнутий успіх, Чалфі все ще був здивований тим прогресом, до якого призвів GFP. “Я, звичайно, розумів, що прикріплення флуоресцентних міток до підмножини клітин може бути важливим. Але чого я ніколи не міг припустити, так це всіх тих чудових адаптацій і модифікацій, які придумали інші, що дійсно зробили GFP корисним і ефективним інструментом”.

Пояснення поведінки GFP з’явилися лише після того, як в 1994 році до цієї роботи підключився Роджер Тсієн (Roger Tsien). Цьєн вже був добре відомий в цій галузі завдяки своїм безпрецедентним дослідженням клітин, наприклад, розробці барвників, які змінюють колір при контакті з іонами кальцію.

Джеремі Сандерс, який був науковим керівником Тсієна під час його захисту докторської дисертації в Кембриджському університеті, Великобританія, каже, що робота Тсієна до його дослідження GFP “відкрила цілий новий світ для погляду на те, що відбувається всередині живих клітин”. “У певний момент протягом 1980-х років майже третина всіх робіт, опублікованих в галузі фізіології, цитувала роботу Цієна”.

Для початку Тсьєн склав схему того, як формується хромофор GFP у 238 амінокислотному ланцюгу. Секрет полягає в тому, як білок згортається, набуваючи бочкоподібної форми, з трьома ключовими амінокислотами (послідовність серин-тирозин-гліцин), щільно згорнутими разом в центрі. Цьєн показав, як ці три амінокислоти можуть вступати в реакцію з киснем навколишнього середовища, створюючи флуоресцентний хромофор.

Далі він взявся за роботу над удосконаленням. “Дикий тип GFP був створений для власних цілей медузи, тому він, очевидно, не був ідеальним для наших цілей”, – говорить Цьєн, зазначаючи, що GFP мав тенденцію втрачати здатність світитися з часом, а зелений колір не завжди був ідеальним для практичних досліджень.

“Ми виявили, що певна амінокислота може змінювати основний колір випромінювання, але інші амінокислоти також відіграють меншу роль”, – пояснює він. Поступово вносячи мутації в ген, обережно змінюючи амінокислоти, Цьєн зміг налаштувати GFP, щоб створити широку палітру кольорів і поліпшити загальну яскравість.

Нові кольори стали важливим кроком вперед, оскільки вони дозволили вченим зображати кілька різних клітин одночасно і вивчати, як різні системи взаємодіють в реальному часі.

По той бік мозку

Єдине, що Цзену ще не вдавалося зробити, це виробляти світло в напрямку червоного кінця спектру – це дуже корисно, оскільки воно може легше проникати в біологічні тканини. Поворотний момент настав, коли Сергій Лук’янов з Інституту біоорганічної хімії ім. Шемякіна в Москві, Росія, відкрив у коралах GFP-подібний білок, який отримав назву DsRED.

Джерело: © AFP/GETTY IMAGES

Мозковий місток був унікальною кольоровою картою мозку

“Червоні білки з коралів були більшими і мали тенденцію до утворення тетрамерів, тому вони потребували значних модифікацій, щоб зробити їх зручними для користувача”, – говорить Цьєн. В результаті з’явилася нова серія смачних білків з назвами mPlum та mStrawberry, що вказують на різні відтінки.

Мабуть, найяскравіша демонстрація нового сімейства відбулася, коли команда Гарвардського університету під керівництвом Джеффа Ліхтмана в 2007 році пофарбувала нейрони у мишей в калейдоскоп з 90 різних кольорів – даючи їм можливість шукати унікальні візерунки.

Гірко-солодка премія

Правила Нобелівської премії обмежують її присудження максимум трьома особами. І, як і багато інших важливих відкриттів, у розробку GFP внесли свій внесок більше вчених. Цього року людина, яка клонувала і секвенувала ген GFP, і яка першою уявила його потенціал, Дуглас Прашер, пропустила цю найпрестижнішу з нагород. Набагато гірше те, що кар’єра Прашера була обірвана. Він не зміг знайти фінансування для своїх досліджень і повністю залишив науку. Зараз він працює водієм автобуса.

“Те, що Даг не був визнаний, безумовно, додає премії гірко-солодкого елементу, – каже Чалфі. Я думаю, що для Нобелівського комітету це, мабуть, було болісним рішенням, і вони могли б легко віддати премію Дагу, а не мені”.

Цьєн також визнає внесок Прашера: “Шкода, що Даг останнім часом не мав можливості займатися наукою. Я сподіваюся, що вся ця публічність призведе до того, що Даг знову зможе робити те, до чого він дійсно талановитий”.

Чи не занадто велика роль біології в присудженні Нобелівської премії з хімії – питання, яке піднімається майже щороку. “Наша робота, безумовно, знаходиться на межі між хімією і біологією, але ми робили її не для того, щоб отримати Нобелівську премію – ми робили її тому, що вона була науково важливою і цікавою в той час”, – говорить Цзен.

Чалфі погоджується і ставить свою роботу на межу між науками. “Я думаю, що бар’єри між різними науковими відділами стають все більш і більш пористими. І я думаю, що Шведська академія, безумовно, визнала це”. Без хімії GFP широкий спектр важливих біологічних застосувань був би неможливий.

Source: rsc.org